ESOSOMI COME FONTE DI BIOMARKERS PER CARCINOMA MAMMARIO. APPROCCIO PROTEOMICO.

Senza dubbio decenni di ricerche hanno contribuito al miglioramento degli esiti di pazienti malati di cancro, ma due problematiche restano ancora evidenti: la creazione di terapie più efficaci e specifiche e l’identificazione di nuovi biomarkers utili per ottimizzare diagnosi e prognosi. Queste richieste sono diventate più urgenti che mai a causa dell’eterogeneità e complessità dei tumori. A questo proposito, gli esosomi, vescicole racchiuse da membrana che vengono rilasciate dalle cellule nello spazio interstiziale, stanno emergendo come potenziali riserve di biomarkers per la diagnosi e per la progressione tumorale. Dal momento che molte proteine sono differentemente espresse in alcuni stadi e tipi di tumore mammario e, data la mancanza di markers e targets specifici, dalla caratterizzazione di queste vescicole potrebbero derivare grandi benefici. In particolare, il nostro interesse si è focalizzato sulla progressione del tumore e sui suoi caratteri di aggressività e invasività attraverso lo studio dell’espressione proteica differenziale di esosomi derivati da linee cellulari di carcinoma mammario con diverso grado di malignità. A questo scopo, abbiamo selezionato una linea cellulare di carcinoma mammario altamente invasiva MDA-MB-231 e, come controllo, abbiamo utilizzato la stessa linea cellulare geneticamente modificata per perdere i suoi caratteri di invasività, Slug-shRNA MDA-MB-231. E’ stato messo a punto un metodo di centrifugazione differenziale per la purificazione di esosomi e, per testarne l’efficacia e quantificare il numero e la dimensione degli esosomi purificati, i pellets sono stati osservati al microscopio elettronico a trasmissione. Successivamente è stata eseguita l’analisi proteomica mediante elettroforesi bidimensionale, seguita da analisi con software PD-quest per l’identificazione di spots proteici differentemente espressi e statisticamente significativi. 18 Spots sono stati processati e analizzati mediante spettrometria di massa. 9 Proteine su 18 sono risultate up-regolate negli esosomi della linea cellulare più aggressiva, mentre 9 sono risultate down-regolate. Le proteine identificate possono essere presentate con dei raggruppamenti fatti sulla base delle loro funzioni: proteine di segnalazione (β2-microglobulin, guanine nucleotide binding protein, hedgehog-interacting protein, peptidyl-prolyl cis-trans isomerase, cartilage intermediate layer protein 1, GA-binding protein), proteine coinvolte nella risposta cellulare allo stress (NDRG1, Annexin A2, PEDF), proteine coinvolte nel metabolismo cellulare (triosephosphate isomerase, phosphoglycerate mutase 1, apolipoprotein A1, phosphatidylinositol 5-phosphate 4-kinase 2α, NAMPT, melanoma associated antigen E2), proteine che regolano il ciclo cellulare (CLIC1) o il processo di coagulazione (Annexin 5). Tutte queste proteine correlano con l’aggressività del tumore. Per confermare la presenza esclusiva di queste proteine all’interno degli esosomi, anche le proteine differentemente espresse nei lisati cellulari delle due linee testate sono state analizzate mediante spettrometria di massa: i pattern proteici delle cellule sono risultati differenti da quelli degli esosomi e la linea cellulare altamente invasiva non ha mostrato over-espressione di quelle proteine trovate up-regolate nei corrispondenti esosomi. E’ ragionevole pensare che le vescicole contribuiscano in qualche modo agli eventi di iniziazione, progressione e infiltrazione tumorale. Potrebbero ad esempio trasmettere quei messaggi necessari per aumentare la malignità di cellule neoplastiche o addirittura condurre alla trasformazione di cellule non cancerose. Pertanto, la ricerca di biomarkers per carcinoma mammario o altre forme tumorali potrebbe ottenere risposte promettenti dall’attenta caratterizzazione del contenuto degli esosomi.