BASI GENETICHE DELLA TOLLERANZA AL FREDDO IN ORZO (HORDEUM VULGARE L.)

Temperature al di sotto dello zero rappresentano una delle maggiori limitazioni per il potenziale produttivo dell’orzo (Hordeum vulgare L.). La tolleranza a tali temperature dipende da un processo fisiologico noto come acclimatamento. Quest’ultimo è principalmente mediato da fattori di trascrizioni chiamati C-repeat binding factors (CBF) in grado di modulare l’espressione di multipli geni effettori che a loro volta provvedono a ripristinare la fisiologica omeostasi cellulare. Studi genetici condotti in orzo hanno dimostrato che gran parte della variazione fenotipica osservata nella tolleranza alle basse temperature è spiegata da due QTL (Quantitative Trait Loci), Fr-H1 and Fr-H2, localizzati sul braccio lungo del cromosoma 5H. Fr-H1 coincide con il locus Vrn-H1 implicato nella richiesta di vernalizzazione, mentre Fr-H2 segrega con un cluster di più di 13 geni codificanti per HvCBF. Diversi studi sono stati condotti per investigare il meccanismo di azione di tali QTL. Recentemente è stato dimostrato che l’acquisizione della tolleranza al freddo potrebbe essere legata a una specifica tipologia di variazione strutturale nota come Copy Number Variation (CNV), definita come un cambiamento sbilanciato nella struttura del genoma che include inserzioni, delezioni e duplicazioni. In particolare, lo studio ha rivelato che genotipi con un maggior numero di copie di HvCBF4 e HvCBF2 mostravano un aumento nella tolleranza al freddo. Al contrario, un ruolo negativo è stato trovato per il HvCBF3. La presente tesi di dottorato ha come obiettivo principale quello di fare ulteriore luce sui meccanismi genetici e molecolari coinvolti nella tolleranza al freddo in orzo. In particolare, nella prima parte del lavoro è stata ricostruita la sequenza del locus Fr-H2 nella cultivar invernale resistente al freddo ‘Nure’. La sequenza, ottenuta mediante tecnologia PacBio, è stata sottoposta a dettagliata annotazione strutturale e funzionale e curata manualmente. I risultati sono poi stati confrontati con il corrispondente locus del genotipo di riferimento ‘Morex’, primaverile e suscettibile al freddo. La comparazione strutturale ha rivelato interessanti variazioni strutturali come ad esempio il CNV per il segmento HvCBF4-HvCBF2 nella parte prossimale del cluster di CBF e due inversioni nella parte centro-distale del locus. Ulteriori differenze hanno riguardato la composizione genica e degli elementi ripetuti. Nella seconda parte del lavoro è seguita la validazione funzionale tramite qRT-PCR di alcuni geni nel cluster di HvCBF: HvCBF4, HvCBF2 e HvCBF14. L’espressione è stata analizzata per due cultivar contrapposte per la loro capacità di tolleranza al freddo, ‘Tremois’- suscettibile e con 2 copie del segmento HvCBF4-HvCBF2 e ‘Pamina’- resistente e con 12 copie stimate del segmento HvCBF4-HvCBF2, dopo esposizione a 6°C per 2 e 10 ore. Risultati preliminari dimostrano che l’esposizione al freddo determina un cambiamento nell’espressione genica, soprattutto per quanto riguarda il HvCBF14, mentre è possibile ipotizzare differenze nel livello basale di espressione di HvCBF4 in ‘Pamina’ rispetto a ‘Tremois’. Nell’ultima sezione dell’elaborato viene riportato lo sviluppo di nuovo materiale genetico, le linee QTL-NIL (QTL-Near Isogenic Lines), in grado di permettere l’isolamento dell’effetto di ciascun QTL e dei HvCBF. Tramite la separazione dell’effetto dei QTL e dei HvCBF, potrebbe essere possibile chiarire il contributo di ciascun QTL e HvCBF, un eventuale effetto combinato o meccanismi indipendenti dai HvCBF. I risultati ottenuti rappresentano importanti progressi nell’ambito della comprensione delle basi genetiche del fenotipo di resistenza al freddo in orzo.