SVILUPPO DI MODELLI MURINI PER RICAPITOLARE IL PEMFIGO UMANO E VALIDARE NUOVE TERAPIE

Il pemfigo è una rara malattia bollosa della pelle di origine autoimmune. È caratterizzato dalla perdita di adesione dei cheratinociti (acantolisi) dovuta al legame di autoanticorpi (PVIgG) agli antigeni superficiali presenti sulle membrane dei cheratinociti. Nel pemfigo foliaceo (PF), le IgG patogene bersagliano la desmogleina 1 (Dsg1), mentre nel pemfigo volgare (PV) bersagliano la desmogleina 3 (Dsg3). Tuttavia, il pemfigo ha anche PVIgG diretti contro proteine non-desmosomiali come i recettori dell’acetilcolina (AChR), sia nicotinici (N) che muscarinici (M), ed i pazienti hanno forme cliniche diverse, basate sui vari antigeni coinvolti. Al fine di ricapitolare la composizione del pool di anticorpi prodotti da ciascun paziente con pemfigo e verificare se i vari tipi di PVIgG possano concorrere a causare acantolisi agendo sinergicamente, proponiamo un'evoluzione del modello murino attivo di pemfigo utilizzato solitamente per studiare questa malattia. In primo luogo, utilizzando il sistema di espressione basato sui Baculovirus e sulle cellule d’insetto, abbiamo prodotto sei proteine ricombinanti murine (rDsg1, rDsg3, desmocollina 3 (rDsc3), rAChRM3, rAChRNα7 e rAChRNα9) che rappresentano i più importanti autoantigeni riconosciuti dai sieri dei pazienti con PV. Abbiamo immunizzato topi Dsg3-/- con la rDsg3 murina ed abbiamo trasferito i loro splenociti in topi immunodeficienti C57BL/6 Rag2-/- (Rag2) che esprimono la Dsg3. I topi riceventi producono in modo stabile le IgG anti-Dsg3 patogene e mostrano il fenotipo del PV mucosale. Abbiamo rotto la tolleranza immunologica immunizzando topi wild type (WT) con la rDsg1 e creato il modello murino attivo del PF attraverso il trasferimento in topi Rag2. Abbiamo anche creato un terzo modello murino (Dsg1/Dsg3) combinando gli splenociti derivati da topi immunizzati con la rDsg1 e topi immunizzati con la rDsg3 e quindi trasferendo il pool di cellule nei topi Rag2. Per valutare l'attività della malattia nei modelli murini, abbiamo utilizzato un PV score basato sull'ispezione visiva e la perdita di peso corporea, che è causata dall'inibizione dell'assunzione di cibo e riflette la portata delle erosioni orali. Abbiamo anche valutato la presenza di autoanticorpi nel siero dei topi Rag2 riceventi mediante ELISA. Inoltre, abbiamo testato il metilprednisolone (m-PSL), attualmente utilizzato per trattare i pazienti con PV, nel modello murino recentemente sviluppato. Il modello murino Dsg1/Dsg3 con il fenotipo più grave, riproduce i sintomi del PV mucocutaneo dei pazienti, così come lo stesso livello di distacco intraepiteliale e uguali depositi intercheratinocitari di IgG. Tutti i nostri modelli hanno risposto parzialmente al trattamento farmacologico. I sieri dei pazienti con pemfigo contengono livelli più alti di fattori umorali rispetto ai sieri provenienti da soggetti sani. Per convalidare il ruolo di uno di questi fattori, abbiamo trattato i topi con pemfigo attivo con un nuovo farmaco sperimentale non immunosoppressivo che ha migliorato parzialmente la malattia. Le immunizzazioni di topi WT con le altre proteine ricombinanti sono in corso, al fine di raggiungere il nostro obiettivo globale di ricreare modelli animali multipli (singoli, coppie e combinazioni di tre o più autoantigeni) che dovrebbero riflettere i vari fenotipi del pemfigo. In conclusione, abbiamo creato nuovi strumenti che migliorano la conoscenza dei patomeccanismi del pemfigo e serviranno per l'identificazione di nuovi bersagli terapeutici e la valutazione preclinica dell'efficacia di nuovi farmaci.