Saggio di coltivazione seriale di cheratinociti come nuovo test di sicurezza per la terapia ex-vivo cellulare e genica dell'Epidermolisi Bollosa.

L’Epidermolisi Bollosa (EB) è una rara malattia genetica della pelle, causata da mutazioni in geni codificanti diverse proteine della giunzione dermo-epidermica (tra cui LAMB3, COL7A1, COL17A1). L’EB è caratterizzata da fragilità meccanica e strutturale della pelle e delle mucose. Nel 2006, un approccio combinato di terapia cellulare e genica, basato sulla correzione ex-vivo mediata dal retrovirus MLV (murine leukemia virus), ha rappresentato il primo approccio di terapia genica per l’Epidermolisi Bollosa giunzionale (JEB). Tale epidermide, trapiantata stabilmente, si mantiene da oltre 12 anni, in modo funzionale, rinnovandosi in assenza di ricomparsa del fenotipo malattia. Recentemente abbiamo riportato di una terapia salva-vita che ha rigenerato l’intera epidermide di un bambino di 7 anni affetto da una forma molto severa di EB giunzionale (JEB). La dimostrazione dell’attuabilità, dell’efficacia e della sicurezza di questa terapia cellulare e genica ha incoraggiato lo sviluppo di tecnologie simili per trattare altre forme di EB. Sebbene i pazienti trattati non abbiano mostrato la comparsa di eventi avversi durante gli anni del follow-up, è stato opportuno sviluppare dei saggi biologici preclinici volti a valutare la sicurezza della suddetta terapia. Oltre ai classici saggi di sicurezza, abbiamo sviluppato un nuovo saggio biologico basato sulla “coltivazione seriale” dei cheratinociti umani primari trasdotti. Per testare le cellule clonogeniche potenzialmente immortalizzate o trasformate, abbiamo coltivato l’intera popolazione di cellule trasdotte con gli MLV per un numero indefinito di passaggi fino al raggiungimento della senescenza replicativa. Questo saggio, oltre a valutare potenziali eventi di mutagenesi inserzionale, pone le cellule sotto un forte stress proliferativo. Durante la coltivazione seriale di 18 campioni di cheratinociti di pazienti EB corretti geneticamente (un totale di circa 6,6 x 106 cellule clonogeniche), abbiamo notato lo sviluppo di 7 cloni immortalizzati. Nello specifico, 5 di questi cloni immortalizzati sono non trasdotti e solo 2 di questi contengono la correzione genica. All’interno della valutazione dei test preclinici di sicurezza, abbiamo quindi condotto un’analisi sui siti d’integrazione retrovirali, all’interno del DNA estratto dai due cloni contenenti il trasgene, tramite LM-PCR. Grazie a questo approccio, sono state riscontrate 3 integrazioni indipendenti, mappate in modo chiaro all’interno dei cromosomi umani. Nello specifico, 1 integrazione è stata classificata come intergenica, 1 integrazione si trova dentro la sequenza intronica del gene SMARCAL1 ed 1 integrazione è inserita a meno di 10Kb a monte del sito di inizio di trascrizione del gene SLMAP. Tramite PCR quantitativa e analisi proteica è stato dimostrato come i due geni siano egualmente espressi nei cheratinociti di controllo e nei cloni trasdotti. Questi dati mostrano dunque che nessun evento immortalizzante è correlato alle integrazioni del provirus nei cheratinociti trasdotti con MLV-RV coltivati in modo seriale.