Studio dei meccanismi molecolari determinanti l’identità cellulare e la sterilità in un ibrido allodiploide Zygosaccharomyces attraverso la biologia sintetica e l’assemblaggio de novo del genoma con le piattaforme MiSeq e MinION

Molti lieviti ibridi interspecifici trovano applicazione nelle biotecnologie alimentari, tuttavia, molti sono incapaci di riprodursi per via sessuale, precludendo l’utilizzo di programmi di breeding. Il complesso Zygosaccharomyces comprende diverse specie naturali interspecifiche e, tra queste, due sono state da poco sequenziate, aprendo una nuova era nella genomica funzionale e comparativa dei lieviti non convenzionali. Studi recenti ipotizzano che ibridi interspecifici di Zygosaccharomyces bailii ripristinano un ciclo sessuale completo in seguito al breakage di un allele del locus codificante il mating-type (MAT). Questo meccansimo evolutivo, responsabile del ripristino della fertilità nell’ancestore di Saccharomyces cerevisiae, risiede nella whole-genome duplication (WGD) avvenuta dopo l’ibridizzazione interspecifica. Zygosaccharomyces rouxii è una cell factory promettente per l’elevata tolleranza ad elevate concentrazioni di soluti. Occupa una posizione filogenetica peculiare nell’evoluzione degli emiascomiceti perché è il primo a divergere da S. cerevisiae prima della WGD. Scopo di questa tesi è elucidare i meccanismi molecolari causa della sterilità nel lievito ibrido modello Z. rouxii ATCC42981, sviluppando strumenti di biologia sintetica e utilizzando le nuove tecniche di sequenziamento del genoma di terza generazione. Inizialmente, abbiamo studiato il ciclo vitale del ceppo tipo Z. rouxii CBS732T, focalizzandoci su come lo switching del mating-type agisca da meccansimo plastico che determina instabilità genetica intra individuo e novità fenotipiche in cellule aploidi derivanti da differenti colture stock del ceppo omotallico CBS732T. Poi, abbiamo caratterizzato il sistema determinante il sesso nell’allodiploide e sterile ATCC42981, utilizzandolo come modello per studiare come un assetto chimerico di geni MAT possa contribuire all’isolamento riproduttivo negli ibridi. Il sequenziamento del genoma di ATCC42981, integrando due piattaforme di sequenziamento diverse, Illumina MiSeq e Oxford Nanopore MinION, ci ha aiutato a decifrare le basi genetiche della sterilità negli ibridi e dell’adattamento a stress ambientali nei lieviti non convenzionali. L’assemblaggio iniziale è risultato in 33 scaffolds con una dimensione totale del genoma di 20.9 Mb; 10,254 geni sono stati annotati con Exonerate v2.2.0 per similarità al ceppo aploide più vicino CBS732T. Dal confronto con quest’ultimo è emerso che il genoma di ATCC42981 è 2.14 volte più grande di quello del CBS732T e contiene quasi il doppio dei geni. La predizione e annotazione dei geni è stata ulteriormente migliorata combinando metodi ab initio e basati sull’evidenza. 10,821 geni codificanti proteine sono stati annotati con Yeast Genome Annotation Pipeline (YGAP) e 10,521 usando la pipeline di Funannotate. Sulla base della sintenia degli scaffolds, dei geni ortologhi e omeomologhi, tre aplotipi sono stati identificati, uno di questi quasi identico al CBS732T, suggerendo un modello di ibridizzazione ripetuta. Il sequenziamento del genoma ha aiutato anche a risolvere l’organizzazione strutturale incongruente dei loci MAT tra due differenti colture stock di ATCC42981: la nostra sterile e quella giapponese fertile chimata JCM22060. L’ assetto dei loci MAT è divergnte e, a differenza di JCM22060, ATCC42981 ne trascive due. Abbiamo dimostrato che la delezione del locus MATα in ATCC42981 non è sufficiente a ripristinare l’ sporulazione o il mating, dato che l’incompleto silenziamento di HMLα maschera la perdita di eterozigosità nel locus MAT a seguito della delezione. Nel complesso, i nostri risultati contribuiscono a chiarire i meccanismi responsabili della sterilità negli ibridi e i circuiti che determinano l’identità cellulare nella specie pre-WGD Z. rouxii.