Sistema CRISPR/Cas9 per silenziare in modo specifico la mutazione dominante P347S del gene Rodopsina

Le mutazioni che coinvolgono il gene Rodopsina (RHO) rappresentano un’importante causa di sviluppo della cecità. Il 25-30% di tali mutazioni è caratterizzato da mutazioni dominanti associate alla Retinite Pigmentosa (adRP), mentre la restante parte rappresenta l’8-10% di tutte le RP. In adRP la mutazione su un singolo allele è sufficiente per lo sviluppo della malattia. Per questa ragione, lo sviluppo del sistema CRISPR/Cas9 come strumento genico per silenziare in modo specifico l’allele difettivo RHO rappresenta un valido approccio terapeutico. La nucleasi Cas9 induce un doppio taglio del DNA principalmente mediante l’introduzione di inserzioni/delezioni (InDels) a livello della regione bersaglio portando ad un silenziamento genico permanente. In questo studio è stata analizzata l’efficacia e la specificità della S.pyogenes Cas9 (Cas9) e della variante high-fidelity VQR (Cas9-VQRHF1) per inattivare la mutazione dominante RHO P347S. La sostituzione dell’ aminoacido P347S nella regione C-terminale della proteina RHO ha un ruolo nel corretto traffico dell’ opsina nei fotorecettori. Due vettori effettori portanti due specifici gRNAs e le rispettive Cas9 sono stati generati e testati in vitro e in topi transgenici P347S. Per la parte in vitro, i plasmidi sono stati trasfettati in cloni stabilmente esprimenti il cDNA RHO P347S o wild-type (wt). La frequenza e i tipi di InDels nel sito bersaglio sono stati analizzati mediante il software TIDE, sequenziamento Sanger e NGS. L’analisi in vitro ha dimostrato che la Cas9 ha una maggiore efficienza di taglio nel locus bersaglio rispetto alla variante, senza evidenziare editing sull’allele wt. Le analisi di RT-PCR e Western Blot nelle cellule stabili Hela P347S editate hanno mostrato una forte riduzione dei livelli di mRNA RHO P347S e di espressione della proteina mutata rispetto ai controlli negativi. Per analizzare le conseguenze derivanti dall’editing sul cDNA RHO P347S è stato eseguito uno studio sui mutanti più frequenti generati dal taglio sito-specifico. Sei mutanti RHO sono stati clonati ed analizzati per la loro espressione, localizzazione e stabilità in cellule CHO. L’ immunofluorescenza ha mostrato una localizzazione principalmente a livello della membrana plasmatica. I saggi di Western Blot e cicloesimide hanno mostrato una riduzione delle proteine mutanti caratterizzate da delezioni >9 nt nel sito bersaglio quando comparati con la proteina wt. Al contrario, i mutanti RHO portanti InDels di 1-2 nt non venivano degradati. Questi mutanti, stabilmente espressi in cellule RPE1 TERT-immortalizzate (iRPE1), hanno mostrato un effetto tossico pari alle cellule iRPE1 esprimenti RHO P347S. L’analisi dei mutanti RHO ha dimostrato che la riduzione della proteina è parzialmente legata ad un meccanismo proteasoma-mediato dei mutanti con delezioni >9nt. Tuttavia, la restante parte dei mutanti RHO non degradati ha mostrato una citotossicità comparabile con il mutante P347S. Al fine di trasferire questa strategia in un modello preclinico in vivo vettori AAV2/8 codificanti per la SpCas9wt o per la SpCas9 VQRHF1 insieme a AAV2/8 portanti i corrispettivi gRNA e una cassetta GFP come gene reporter sono stati generati ed iniettati nella retina di topi transgenici portanti la mutazione RHO P347S. Le analisi di TIDE e NGS hanno permesso di valutare gli InDels generati nel gene Rodopsina P347S. Il test di Optical Coherence Tomography (OCT) non ha mostrato miglioramenti della funzionalità retinica negli occhi trattati dei topi transgenici P347S rispetto ai controlli. Il risultato in vivo dimostra che l’efficienza del sistema deve essere ottimizzata e che la combinazione tra il silenziamento del gene mutato e l’introduzione di cDNA wt esogeno può essere una migliore strategia per il trattamento delle adRP.