Biopolimeri ricombinanti basati su HELP: una piattaforma versatile per realizzare interfacce antimicrobiche per applicazioni ortopediche

Herein, we describe the design, production and characterisation of a fusion construct of the Human Elastin-like Polypeptide (HELP) with indolicidin (named HIn). This work was functional in ascertaining the potential of the HELP carrier for antimicrobial peptide (AMP) production and realising 2D and 3D biomaterials endowed with antimicrobial (AM) activity. The indolicidin domain did not affect HIn production in Escherichia coli nor the thermo-responsive behaviour of HELP, which was employed to purify the fusion protein. HIn AM activity assessment showed that the fusion construct was strongly active toward Pseudomonas aeruginosa and that the HIn-based coatings could extensively disrupt the bacterial cells. In addition, despite the intact HIn-matrices being permissive to bacterial growth, the release of the AMP domain, either by specific endoproteinases or due to elastase degradation of the HELP moiety, restored the AM capacity of indolicidin. Thus, the HIn construct served as a model for producing AMPs and derived materials endowed with AM properties exploiting the HELP fusion carrier. Further, we explored the HELP carrier to produce the difficult-to-synthesize sequence of the human β-defensin 1 (hBD1). This HELP fusion construct, named HhBD1, was successfully produced in E. coli, purified employing the HELP transition properties and physico-chemically characterised. HhBD1 carries six cysteines crucial for its activity since the redox state of the macromolecule determines its AM capacity. Thus, the AM potential of the fusion biopolymer and its release products against E. coli was evidenced using a radial diffusion assay under redox conditions. Unexpectedly, HhBD1-derived materials, such as coatings and matrices, showed a strong cell adhesion-promoting activity, a property that, to our knowledge, has not been described for hBD1 yet. Finally, the possibility of improving the HELP carrier performance was explored. A new Elastin-Like Polypeptide carrier sequence (named UELP) was designed by aligning several vertebrates’ tropoelastin primary structures, and a new synthetic gene was inserted in a plasmid vector for its recombinant expression in E. coli. Its physico-chemical characterisation showed enhanced transition capacity compared to HELP. Intriguingly, UELP displayed a strong potential to induce cell adhesion. Future work will aim to ascertain the suitability of UELP as a carrier for AMP production. These results confirmed that the HELP carrier represents a versatile, environmentally friendly, multitasking platform for cost-effectively producing smart fusion constructs and derived materials endowed with AM capacity. The fusion with the hBD1 showed the potential of the HELP system for functional studies, using the unmodified HELP as the non-functional control. Compared to HELP, the UELP carrier showed enhanced thermo-responsive behaviour and the capacity to promote cell adhesion. These properties highlight its potential for producing AMPs and developing smart AM materials and surfaces.

In questo studio è descritta la progettazione, produzione e caratterizzazione di un costrutto di fusione di polipeptide simile all'elastina umana (HELP) con indolicidina (HIn). Questo lavoro è stato funzionale all'accertamento del potenziale del vettore HELP per la produzione di peptidi antimicrobici (AMP) e alla realizzazione di biomateriali 2D e 3D dotati di attività antimicrobiche (AM). Il dominio dell'indolicidina non ha influenzato la produzione di HIn in Escherichia coli né il comportamento termo-responsivo di HELP, che è stato impiegato per purificare la proteina di fusione. La valutazione dell'attività di HIn AM ha mostrato che il costrutto di fusione era fortemente attivo nei confronti di Pseudomonas aeruginosa e che i rivestimenti a base di HIn potevano distruggere ampiamente le cellule batteriche. Inoltre, nonostante le matrici HIn intatte siano permissive alla crescita batterica, il rilascio del dominio AMP, sia da parte di endoproteinasi specifiche che a causa della degradazione dell'elastasi della porzione HELP, ha ripristinato la capacità AM dell'indolicidina. Pertanto, il costrutto HIn è servito da modello per la produzione di AMP e materiali derivati dotati di proprietà AM sfruttando il vettore di fusione HELP. Inoltre, è stato esplorato il vettore HELP per produrre la sequenza difficile da sintetizzare della β-defensina 1 umana (hBD1). Questo costrutto di fusione, denominato HhBD1, è stato prodotto e purificato utilizzando le proprietà di transizione HELP e caratterizzato dal punto di vista fisico-chimico. HhBD1 ha sei cisteine cruciali per la sua attività poiché lo stato redox della macromolecola determina la sua capacità AM. Pertanto, il potenziale AM del biopolimero di fusione e dei suoi prodotti di rilascio contro E. coli è stato evidenziato utilizzando un test di diffusione radiale in condizioni redox. Inaspettatamente, i materiali derivati da HhBD1, hanno mostrato una forte attività di promozione dell'adesione cellulare, una proprietà che, a nostra conoscenza, non è stata ancora descritta per hBD1. Infine, è stata esplorata la possibilità di migliorare le prestazioni del vettore HELP. Una nuova sequenza portante dell'ELP (UELP) è stata progettata allineando le strutture primarie della tropoelastina di diversi vertebrati e un nuovo gene sintetico è stato inserito in un vettore plasmidico per la sua espressione ricombinante in E. coli. La sua caratterizzazione fisico-chimica ha mostrato una maggiore capacità di transizione rispetto a HELP. Inoltre, UELP ha mostrato un forte potenziale nell’indurre l'adesione cellulare. Questi risultati hanno confermato che il vettore HELP rappresenta una piattaforma versatile, ecologica e multiuso per la produzione economicamente vantaggiosa di costrutti di fusione intelligente e materiali derivati dotati di capacità AM. La fusione con hBD1 ha mostrato il potenziale del sistema HELP per studi funzionali, utilizzando HELP non modificato come controllo non funzionale. Il vettore UELP ha mostrato un comportamento termo-reattivo migliorato e la capacità di promuovere l'adesione cellulare. Queste proprietà ne evidenziano il potenziale per la produzione di AMP e lo sviluppo di materiali e superfici funzionalizzatte con AMPs.