Drug discovery in cancer research: hit identification using a fragment-based by NMR approach

Bcl-XL (B-cell-lymphoma-extra large) e il recettore transmembrana CD44, sono due proteine coinvolte nel cancro. In particolare, la proteina anti-apoptotica Bcl-XL, membro della famiglia di Bcl-2, gioca un ruolo chiave nel mantenimento della normale omeostasi cellulare. Tuttavia, la sua sovraespressione può portare alla trasformazione oncogenica ed è responsabile per la resistenza ai farmaci in alcuni tipi di cancro. Strutturalmente, questa famiglia è caratterizzata dalla presenza di domini BH, che sono coinvolti in fondamentali interazioni proteina-proteina. La proteina anti-apoptotica Bcl-XL interagisce attraverso la sua tasca idrofobica con il dominio BH3 dei membri pro-apoptotici della famiglia Bcl-2, come BAK e BAX. L'inibizione di questa interazione favorisce infine la morte cellulare. Il recettore di superficie cellulare CD44, è una glicoproteina di transmembrana di tipo I, ed è una proteina che lega l’acido ialuronico espresso sulla superficie di molti tipi di cellule, in cui è coinvolta nella migrazione dei leucociti ai siti di infiammazione, nell'attivazione delle cellule T e nelle metastasi tumorali. Critico per questi processi sono le interazioni tra CD44 e il suo ligando naturale, l’acido ialuronico (HA). Il coinvolgimento di CD44 nella migrazione cellulare e la sua sovraespressione su un ampio spettro di cellule tumorali, rendono questo recettore un buon bersaglio per la progettazione di nuovi farmaci e per il drug delivery di chemioterapici in cellule tumorali. Nella prima parte della tesi, con l'obiettivo di individuare un inibitore di Bcl-XL, abbiamo testato una piccola libreria di frammenti contro Bcl-XL utilizzando come tecnica la spettroscopia di Risonanza Magnetica Nucleare (NMR) in soluzione. Tra questi uno è risultato essere attivo con una Kd nel basso millimolare. Partendo da questo hit iniziale, abbiamo effettuato degli studi di relazione struttura-attività (SAR) di diversi analoghi, utilizzando sia esperimenti NMR che guardano alla proteina (soprattutto 2D [1H, 15N] -HSQC) ed esperimenti NMR concentrati sul ligando (Saturation Transfer Difference (STD) e waterLOGSY). I nostri studi hanno portato ad un frammento con un Kd di 811 μM calcolati utilizzando le perturbazioni di chemical shift (CSP) dagli spettri 2D [1H, 15N]-HSQC. Dagli studi di docking molecolare condotti utilizzando le informazioni di CSP sperimentalmente ottenute, ci hanno permesso di ottenere una conformazione a bassa energia del frammento finale nella tasca di legame idrofobica di Bcl-XL. La seconda parte di questa tesi riguarda CD44, una proteina che dai dati strutturali non è un target particolarmente ‘druggable’ e solo pochi agenti leganti sono noti per legarla in saggi cellulari. Per prima cosa abbiamo cercato di convalidare tali agenti leganti noti con metodi biofisici, ma sorprendentemente abbiamo trovato che, con l'eccezione di HA e un anticorpo disponibile in commercio, nessuno di questi lega apprezzabilmente la proteina ricombinante hCD44(21-178). Nel perseguire dei possibili nuovi antagonisti di CD44 abbiamo effettuato una campagna di screening di frammenti sulla proteina 15N-hCD44(21- 178) utilizzando esperimenti NMR 1D 1H-alifatici e 2D [1H, 15N]-sofastHMQC come metodi di rilevamento. Abbiamo trovato due hit iniziali strutturalmente affini e partendo da questi abbiamo effettuato ulteriori studi utilizzando analoghi disponibili in commercio. Questi esperimenti hanno portato in un frammento con una costante di dissociazione calcolata con la perturbazione di chemical shift dagli esperimenti 2D [1H, 15N]-sofastHMQC di 7,43 mM. In conclusione Bcl-XL e CD44 sono entrambe sovraespresse in molti tipi di cellule tumorali. Per questo motivo trovare agenti leganti capaci di inibire queste due proteine è un compito molto attraente per lo sviluppo di nuovi chemioterapici. Utilizzando un approccio NMR basato sui frammenti, abbiamo trovato per entrambi i target due hit che potrebbero essere la base per ulteriori studi di evoluzione del frammento per lo sviluppo di composti lead più potenti.