Molecular Characterization of A Novel Mutation In The Renal NaCl Cotransporter Causing Gitelman' s Syndrome By Impairing Transporter Trafficking

Le mutazioni che colpiscono il cotrasportatore per il sodio e cloro (NCC) nel tubulo contorto distale del nefrone, sono responsabili della sindrome di Gitelman (GS). Quest' ultima è una rara tubulopatia renale autosomica recessiva caratterizzata da alterazioni elettrolitiche simili a quelle indotte dal trattamento ad alte dosi con diuretici tiazidici. La co-presenza di ipomagnesemia e ipocalciuria è una delle caratteristiche di GS che la distinguono da un'altra tubulopatia renale ipokalemica, la sindrome di Bartter (BS). Generalmente, i soggetti affetti sono eterozigoti composti con una prevalenza stimata di 1 su 40000. La malattia può essere silente per anni prima di presentarsi nell' età  adulta. Riconoscerne la componente genetica è fondamentale per lo screening e la diagnosi. Recenti studi hanno di fatto dimostrato come le mutazioni a carico dei regolatori renali dell' omeostasi del sodio siano sottostimate nella popolazione generale. Nel nostro database universitario di pazienti BS/GS abbiamo riscontrato una nuova mutazione puntiforme (c.1204G>A che comporta lo scambio aminoacidico Gly394Asp) nel cotrasportatore del sodio e cloro NCC (SLC12A3) in una giovane donna con ipokaliemia, ipomagnesemia e ipocalciuria associati a dolori e crampi muscolari. Il presente studio ha lo scopo di investigare tramite un approccio biologico molecolare come questa mutazione influenzi la funzionalità  di NCC. Previo screening con softwares bioinformatici che predicono la possibile patogenicità  della mutazione, sono stati creati dei vettori di espressione contenenti le sequenze per NCC wild type e per NCC con mutazione G394D. Successivamente, le sequenze sono state trasfettate in una linea di cellule fetali umane ricombinate (HEK293) e in ovociti derivati da rane Xenopus Laevis. Nelle cellule trasfettate, l' immunoblotting di NCC wild-type ha dimostrato la presenza di due bande approssimativamente a 130 KDa e 115 KDa che corrispondono rispettivamente alla forma glicosilata e nativa della proteina. Al contrario, G394D-NCC presenta una sola banda a 115 KDa. Risultati simili sono stati ottenuti negli ovociti. In questi ultimi l' immunoistochimica ha inoltre mostrato una forte localizzazione di NCC wild-type presso la membrana, mentre NCC mutato rimane in compartimenti cellulari interni. Gli studi funzionali di uptake del sodio radioattivo (22Na+) hanno ulteriormente confermato che solo la proteina wild-type è in grado di riassorbire il sodio al contrario di G394D-NCC. I risultati di questo studio dimostrano come la nuova mutazione puntiforme inibisca la funzione di NCC a causa della diminuita capacità della proteina di raggiungere la superficie cellulare. L'assenza di una forma glicosilata matura di G394D-NCC suggerisce che la mutazione ne condizioni il folding e ne provochi la ritenzione nel reticolo endoplasmico ove vengo attivati processi di degradazione anticipata.