Analisi dell'immuno-trascrittoma di cavallo nelle patologie IAD e RAO

Il lavoro di ricerca svolto nell’arco dei tre anni di dottorato, è stato articolato in due progetti sviluppati nell’ambito delle malattie respiratorie su base infiammatoria che colpiscono gli equini. Tali patologie possono essere distinte in due grandi gruppi: Recurrent Airway Obstruction (RAO) ed Inflammatory Airway Disease (IAD). Lo scopo dei progetti di ricerca si è basato sull’indagine dei profili di espressione di geni immuno-correlati nell’albero respiratorio di cavalli affetti da IAD e RAO, in relazione ad un gruppo di controllo. Su tutti i soggetti, sono stati eseguiti gli esami clinici mirati alla valutazione dell’apparato respiratorio, l’esame endoscopico e l’esame citologico e microbiologico da Broncho-Alveolar Lavage (BAL), per valutare le potenziali correlazioni esistenti tra i profili di espressione genica ed i parametri clinici. Il primo progetto è stato sviluppato comparando cavalli sani con soggetti affetti da RAO, su cui i campionamenti sono stati ripetuti due volte nell’arco di 15 giorni, al fine valutare una potenziale evoluzione temporale dell’espressione genica e degli altri parametri considerati nella ricerca. Inoltre, sono state eseguite biopsie del tessuto bronchiale, sottoposto sia a valutazione istologica che ad analisi di espressione genica. Mediante real time RT-PCR, sono stati indagati i profili di espressione di 10 geni target immuno-correlati (IL-1ß, IL-6, IL-8, IL-13, IL-17, TNFa, INF?, TGF-ß1, NF?-ß e TRL 4), sei dei quali hanno dimostrato una aumento statisticamente significativo dei livelli di espressione nel gruppo RAO rispetto al gruppo di controllo. Le analisi statistiche condotte, hanno riscontrato una correlazione positiva tra la quantità di muco nelle vie aeree e l’ espressione di alcuni dei geni indagati. Non sono state evidenziate differenze di espressione, dei geni inclusi nello studio, tra i tessuti bioptici prelevati dai soggetti affetti da RAO e quelli ottenuti dal gruppo di controllo. Il secondo progetto di ricerca, è stato sviluppato ampliando la casistica dei cavalli affetti da RAO ed introducendo lo studio della IAD. Su tutti i soggetti, le indagini cliniche e le valutazioni dei profili di espressione genica sono state condotte sia al momento della diagnosi che al termine del trattamento farmacologico della durata di 15 giorni. Valutati i risultati del primo lavoro, non sono state eseguite biopsie del tessuto respiratorio. Lo sviluppo di una piattaforma microarray specifica per i geni immuno-correlati di cavallo ha permesso di ottenere una visione globale dei pathway coinvolti nella risposta infiammatoria delle due patologie. Le analisi statistiche effettuate hanno evidenziato una differenza di espressione significativa per 379 trascritti (di cui 55 sovra-espressi e 324 sotto-espressi) tra il gruppo IAD ed il gruppo di controllo e per 1763 geni (di cui 903 sovra-espressi e 860 sotto-espressi) tra i pazienti affetti da RAO ed i soggetti sani. Da un punto di vista clinico, sono state riscontrate differenze statisticamente significative sia della frequenza respiratoria a riposo che della quantità di muco presente nelle vie aeree dei cavalli affetti da IAD rispetto ai soggetti RAO. Tra i geni sotto-espressi nei due gruppi di cavalli affetti da malattia respiratoria, hanno acquistato importanza alcuni trascritti coinvolti nella genesi, lunghezza e motilità dell’apparato ciliare dell’epitelio respiratorio. Nella popolazione IAD, è stata dimostrata la sovra-espressione di geni codificanti per mediatori coinvolti nella risposta infiammatoria. I geni sovra-espressi nel gruppo RAO, caratterizzati da maggior rilievo, sono coinvolti nella risposta infiammatoria, nella broncocostrizione, nella via apoptotica e nel pathway dell’ipossia. Nella medesima patologia, si sono mostrati sotto-espressi anche alcuni geni coinvolti nella genesi del film muco-proteico di protezione dell’epitelio respiratorio. Lo studio condotto mediante Gene Set Enrichment Analysis (GSEA), ha evidenziato che il pathway attivato in corso di asma umano, viene arricchito anche nella patologia RAO equina, sebbene la significatività statistica sia marginale (False Discovery Rate < 25%, p value 0,08). Non è stato possibile valutare l’effetto della terapia farmacologica sui profili di espressione genica, poiché la bassa qualità dell’RNA estratto dal BAL di alcuni campioni non ha permesso di raggiungere un numero significativo di soggetti valutati prima e dopo il trattamento terapeutico. Gli studi effettuati hanno quindi permesso di far luce su alcuni dei meccanismi immunologici che stanno alla base delle patologie respiratorie equine di maggiore importanza veterinaria ed economica. In futuro, le informazioni ottenute, potrebbero condurre allo sviluppo di nuovi mezzi terapeutici per l’inibizione delle molecole coinvolte nello sviluppo di IAD e RAO, come già avviene in medicina umana. Infine, il coinvolgimento di un medesimo pathway nell’asma umano e nella RAO equina, potrebbe condurre all’utilizzo di tale specie come modello animale per lo studio delle patologie respiratorie croniche umane.