Regulation of ER-Mitochondria tethering in an in vivo animal model of Parkinson's disease

I mitocondri formano un network reticolare e tubulare la cui forma è controllata da eventi opposti di fusione e fissione (Bereiter-Hahn and Voth, 1994). Le mitofusine 1 e 2 (Mfn1 e Mfn2), sono delle GTPasi dynamin-like incorporate nella membrana mitocondriale esterna (OMM, outer mitochondrial membrane) e mediano la fusione mitocondriale in cooperazione con OPA1 (Rojo et al., 2002; Santel and Fuller, 2001; Wong et al., 2000). Le shaping protein mitocondriali hanno una funzione pleiotropica. In particolare, mentre la Mfn1 sembra principalmente coinvolta nel docking e nella fusione di organelli, la Mfn2 è arricchita nei punti di contatto tra ER e mitocondri dove è implicata nella formazione di collegamenti molecolari che sono capaci di produrre un'interazione tra gli organelli (Chen et al., 2012; de Brito and Scorrano, 2008). Lavori recenti attribuiscono a questi punti di stretto contatto tra l'OMM e il vicino ER, chiamati MAMs (mitochondria-associated ER-membranes) o MERCS (mitochondria-ER contacts), un importante ruolo nella propagazione del segnale cellulare, incluso quello che controlla il metabolismo lipidico, l'omeostasi del calcio (Ca2+) e la morte cellulare (Rowland et al., 2012; Rizzuto et al., 1998; Vance, 1990). Un'anomalia nella comunicazione tra ER e mitocondri è stata descritta in vari modelli cellulari di differenti malattie neurodegenerative, che includono la malattia di Alzheimer, Huntington e Parkinson (Krols et al., 2016; Calì et al., 2013; Ottolini et al., 2013; Area-Gomez et al., 2012; Calì et al., 2012; Panov et al., 2002). Tuttavia la causa esatta che induce la perdita neuronale non è ancora conosciuta. Parkin, una E3-ubiquitina ligasi mutata nelle forme familiari di malattia di Parkinson (PD, Parkinson's disease) è selettivamente reclutata sui mitocondri disfunzionali e promuove la loro eliminazione tramite autofagia, un processo conosciuto come mitofagia (Narendra et al., 2008). PINK1, una proteina chinasica e gene associata alla PD, è richiesto per il reclutamento di Parkin e per la mitofagia indotta da stress (Ziviani et al., 2010). Nei diversi sistemi modello, Parkin ubiquitina selettivamente le proteine ancorate sulla membrana mitocondriale esterna che promuovono la fusione (Mfn1 e Mfn2) e il loro omologo in Drosophila (Marf) (Tanaka et al., 2010; Ziviani et al., 2010; Gegg et al., 2010). Di conseguenza, l'assenza di Parkin o PINK1, il quale opera a monte di Parkin nella stessa pathway, causa un'alterazione nell'ubiquitinazione della Mfn e un aumento dei livelli di Mfn (Ziviani et al., 2010). Dato che Parkin altera i livelli basali e di ubiquitinazione della Mfn, noi abbiamo proposto di (i) valutare i livelli di ubiquitinazione della mitofusina ed analizzare se la downregolazione di Parkin ha effetti su questi livelli; (ii) investigare se Parkin regola il legame tra ER e mitocondri andando ad agire sui livelli stazionari o di ubiquitinazione della Mfn2; (iii) valutare il significato fisiologico dell'interazione ER-mitocondri in un modello animale in vivo di malattia di Parkinson. La nostra ipotesi è che l'ubiquitinazione della Mfn Parkin-dipendente controlli il legame ER-mitocondri, interferendo così con il trasferimento e l'omeostasi di Ca2+, la cui alterazione è stata descritta in numerose pathway molecolari che causano neurodegenerazione associata alla perdita di funzionalità  di PINK1 e Parkin (Calì et al., 2013; Ottolini et al., 2013; Calì et al., 2012). Al fine di affrontare la precedente lista di ipotesi abbiamo analizzato i livelli di ubiquitinazione della Mfn2 in fibroblasti embrionali di topo (MEFs: mouse embryonic fibroblasts) in seguito alla downregolazione di Parkin. A questo scopo, abbiamo (i) immunoprecipitato la Mfn2 con lo specifico anticorpo anti Mfn2 ed eseguito il western blotting con lo specifico anticorpo anti HA in cellule overesprimenti l'ubiquitina taggata HA; (ii) misurato i livelli di connessione tra ER e mitocondri nelle cellule di controllo e in cellule con Parkin downregolato. Abbiamo utilizzato due approcci indipendenti per misurare questa connessione: per prima cosa abbiamo misurato la percentuale di co-localizzazione dell'ER con i mitocondri usando il coefficiente di co-localizzazione di Mander in seguito alla ricostruzione volumetrica 3D delle immagini confocali lungo l'asse z di cellule esprimenti le sonde fluorescenti bersaglio degli organelli (rispettivamente, mito-RFP and ER-YFP) (Rizzuto et al., 1998). In secondo luogo, abbiamo sfruttato una sonda basata su FRET (Naon et al., 2016) per misurare la vicinanza dell'ER con i mitocondri. In questo sensore, chiamato FEMP, l'intensità  di FRET è inversamente proporzionale alla distanza tra i due fluorofori (mito-YFP e ER-CFP) che sono opportunamente indirizzati ai due compartimenti. (iii) Abbiamo studiato il significato fisiologico dell'interazione ER-mitocondrio in un modello animale in vivo di PD privo dell'espressione di PINK1. A questo scopo abbiamo usato la Drosophila melanogaster, che ha molti vantaggi. Innanzitutto i mutanti di Drosophila, derivati da mutazioni che causano la perdita di funzionalità  di PINK1, sono stati ampiamente caratterizzati ed inducono un fenotipo robusto rappresentato dalla perdita dei neuroni DA e deficit locomotori correlati all'età  (Poole et al., 2008; Clark et al., 2006; Park et al., 2006; Yang et al., 2006; Wang et al., 2006). In secondo luogo, in vivo possono essere facilmente eseguiti un'ampia varietà  di modifiche genetiche ed esperimenti di epistasi per comprendere più approfonditamente le pathway molecolari. I nostri risultati mostrano che in MEFs la downregolarione di Parkin riduce l'ubiquitinazione della Mfn e l'interazione tra ER e mitocondri. Abbiamo osservato inoltre che le mutazioni della Mfn2 associate a CMT di tipo 2A (rispettivamente Mfn2R94Q, Mfn2P251A e Mfn2R280H) causano l'alterazione dei livelli di ubiquitinazione della Mfn2 ed una diminuzione nell'interazione tra ER e mitocondri. Sebbene indirettamente, questi risultati suggeriscono fortemente che l'ubiquitinazione della Mfn2, piuttosto che i livelli stazionari, è importante nella regolazione dell'interazione tra ER e mitocondri. Per identificare il sito preciso di ubiquitinazione della Mfn2 e correlare direttamente la mancanza dell'ubiquitinazione con la riduzione dell'interazione ER-mitocondri, abbiamo sfruttato un approccio bioinformatico che ci ha permesso di individuare i residui di lisina (K) altamente conservate nelle varie specie. Abbiamo identificato venti residui di lisina che sono conservati tra uomo, topo e Drosophila. Abbiamo confrontato questi residui con quelli descritti in uno studio basato sull'utilizzo della spettrometria di massa per identificare i siti di ubiquitinazione dipendenti da Parkin pubblicato nel 2014 (Bingol et al., 2014). Abbiamo identificato sei residui di lisina che potrebbero rappresentare dei buoni candidati per l'ubiquitinazione Parkin-dipendente della Mfn2. Abbiamo generato i mutanti non ubiquitabili per questi siti sostituendo la lisina (K) con l'arginina (R), una procedura comune per bloccare l'ubiquitinazione e studiato il pattern di ubiquitinazione dei mutanti Mfn2 non ubiquitinabili mediante western blotting. L'espressione del mutante non ubiquitinabile K416R ha provocato un'alterazione dell'ubiquitinazione della Mfn2. Da notare che questo mutante non è stato in grado di ripristinare i contatti ER-mitocondri quando reintrodotto in MEF Mfn2 KO ed ha restaurato solo parzialmente il trasferimento di Ca2+ ER-mitocondriale. In breve, i nostri risultati hanno fornito prove evidenti che l'ubiquitinazione di Mfn2 è un prerequisito per l'interazione fisica e funzionale dei mitocondri con l'ER e che la K416 nel dominio HR1 della Mfn2 è un vero e proprio sito per l'ubiquitinazione Parkin-dipendente. Vari studi hanno osservato in diversi modelli cellulari privi di PINK1 o Parkin un'alterata omeostasi del Ca2+ (Heeman et al., 2011; Sandebring et al., 2009). Sebbene non sia chiaro il motivo per il quale nel PD degenerino specificatamente i neuroni dopaminergici è allettante ipotizzare che un deficit nell'omeostasi del Ca2+, risultante da un alterato scambio di Ca2+ nell'interfaccia ER-mitocondrio, possa portare o contribuire alla degenerazione. Eleganti studi hanno dimostrato che un legame artificiale tra ER e mitocondri può essere usato per modulare il trasferimento di Ca2+ (Csordas et al., 2010; Csordas et al., 2006). Tenendo questo a mente, ci siamo occupati del fatto che l'espressione di un legante sintetico tra ER e mitocondri in un modello in vivo di Drosophila PINK1 loss of function potesse migliorare il fenotipo dei PINK1 KO incidendo sulla comunicazione ER-mitocondriale. Per questo motivo abbiamo generato un certo numero di linee di Drosophila esprimenti il linker sintetico guidato da uno specifico driver neuronale nei neuroni delle ali. Questo linker è stato generato da Csordas et al. (Csordas et al., 2006) e consiste in una proteina monomerica fluorescente (RFP) fusa all'N terminale con la sequenza bersaglio della membrana mitocondriale esterna e fusa al C-terminale con la sequenza bersaglio dell'ER. Abbiamo potuto visualizzare e quantificare i punti di fluorescenza RFP lungo la vena L1 nell'ala della Drosophila dimostrando una corrispondenza con la morfologia osservata a seguito dell'espressione di mito-GFP o ER-GFP sui neuroni dell'ala (Vagnoni e Bullock, 2016), indice del fatto che l'espressione del linker sintetico era appropriata. E' interessante notare che abbiamo osservato un miglioramento dell'abilità  di arrampicata della Drosophila PINK1 KO in seguito all'espressione del linker sintetico artificiale. Questo risultato indica che il ripristino della corretta comunicazione tra ER e mitocondri nel background PINK1 KO può essere utile per migliorare il fenotipo associato ad un modello animale in vivo di PD, aprendo la strada a nuovi approcci per l'intervento medico.