Advanced cell therapy strategies to correct corneal disorders

Introduzione L'omeostasi epiteliale è garantita da cellule staminali somatiche che, attraverso diversi pathways, come quello di p63 o di Notch, si auto-rinnovano, differenziano e controllano la funzione e l'integrità del tessuto. Il comportamento in vivo delle cellule staminali epiteliali (ESC) di diversi epiteli riflette le differenze nel ruolo fisiologico che queste cellule hanno nel tessuto di origine. Il deficit di cellule staminali limbali (LSCD) è caratterizzato da crescita epiteliale congiuntivale, neovascolarizzazione, erosione corneale ricorrente e ulcere persistenti, nonché cicatrici corneali, e porta infine a deficit visivo e cecità. Quando la cornea è interamente coperta da un tessuto fibro-vascolare, le probabilità di successo di una cheratoplastica penetrante tradizionale sono praticamente assenti. Il trapianto di cellule staminali epiteliali autologhe del limbus (LESCs) o di cellule staminali epiteliali della mucosa orale (OMESCs) coltivate su scaffold di fibrina ha dimostrato di avere successo per il trattamento unilaterale o bilaterale di LSCD, rispettivamente. Nonostante ciò, la fibrina presentava numerose limitazioni tra cui l'incapacità di riparare o sostituire lo stroma corneale danneggiato. Scopo Lo scopo di questo lavoro è quello di comprendere meglio la potenzialità delle cellule staminali epiteliali somatiche al fine di identificare possibili approcci per sfruttare questa potenzialità. Alla luce di ciò, il mio gruppo di ricerca è stato in grado di identificare e impostare un approccio di terapia cellulare per un caso unico di mosaicismo omozigote-eterozigote della Sindrome EEC, dimostrando che le cellule staminali epiteliali hanno un potenziale intrinseco per la medicina rigenerativa che può essere sfruttata con una caratterizzazione più profonda. Un secondo scopo della tesi è stato quello di testare gli Human Keratoplasty Lenticules (HKL): scaffolds particolarmente attraenti per la ricostruzione a tutto spessore della superficie anteriore dell’occhio che fornisce, anche, un interessante sistema di coltura organotipica per la valutazione dei processi di crescita, proliferazione e differenziazione delle cellule staminali epiteliali (ESCs ). Risultati Durante i tre anni di dottorato ho avuto l'opportunità di raccogliere e rivedere i dati di biologia cellulare di quattro diversi tipi di cellule epiteliali primarie, derivate da quattro diversi epiteli (pelle, mucosa orale, limbus/cornea e congiuntiva) e, per studiare meglio l'esaurimento del potenziale clonogenico e dell'auto-rinnovamento delle cellule staminali epiteliali abbiamo preso in considerazione anche delle linee cellulari primarie di mucosa orale con difetti genetici del gene p63 già noti per causare un'accelerazione nell'invecchiamento epiteliale, ottenute da tre pazienti affetti da sindrome EEC. Dimostrando che le cellule staminali epiteliali hanno un potenziale intrinseco per la medicina rigenerativa che può essere sfruttato con una caratterizzazione più profonda, siamo stati anche in grado di applicare un protocollo di terapia cellulare a un paziente affetto da sindrome EEC in una rara forma di mosaicismo. Abbiamo isolato la popolazione cellulare con un fenotipo lieve da questo paziente, arricchendo queste cellule primarie in vitro e producendo foglietti epiteliali ben organizzati e stratificati. La novità e l'importanza di questo caso è legata alla possibilità di iniziare un approccio di terapia cellulare personalizzata per questo caso unico di sindrome EEC, basata esclusivamente sulla manipolazione delle cellule staminali epiteliali. Le cellule staminali limbari (H-LESC) coltivate su HKL hanno dato origine a un epitelio squamoso stratificato cheratinizzato morfologicamente simile a quello delle cornee normali. Per costituire la coorte di pazienti animali, abbiamo proceduto alla caratterizzazione di linee cellulari ottenute da biopsie della cornea (C-CESCs) e mucosa orale (C-OMESCs) di origine canina. Le linee primarie sono state propagate in serie fino ad esaurimento al fine di ottenere dati di life span per confrontare il loro comportamento con le cellule staminali limbari umane. Per ogni passaggio, abbiamo anche eseguito analisi di Colony Forming Efficiency (CFE) per stimare la proporzione di cellule clonogeniche presenti nella coltura. I risultati hanno mostrato una tendenza delle linee cellulari canine comparabile all'andamento delle cellule limbari umane, con una diminuzione simile del numero di cellule clonogeniche, una percentuale simile di colonie abortive durante i passaggi in coltura e una simile senescenza replicativa. Quindi, cellule staminali epiteliali primarie umane e canine sono state seminate su HKL. L'epitelio risultante era ben organizzato e stratificato in quattro o cinque strati cellulari con cellule cuboidali basali che differenziano le cellule verso l'alto e quelle alate. Lo strato di cellule cuboidali basali era saldamente attaccato alla matrice extracellulare sottostante e alla membrana basale attraverso l'integrina-4. Sono stati valutati il mantenimento del pool di cellule staminali e i corretti processi di differenziamento controllando l'espressione del marcatore di cellule staminali, p63, e del marcatore di cellule terminalmente differenziate, Involucrina. È importante sottolineare che l'espressione dei diversi marcatori assomiglia a quella osservata negli epiteli normali, suggerendo quindi che gli HKL sono in grado di supportare la crescita e il mantenimento di tessuti epiteliali ricostruiti. Discussione e Conclusioni I nostri risultati dimostrano che le cellule epiteliali primarie hanno caratteristiche uniche con un potenziale inimitabile che le rende uno strumento malleabile, in grado di adattarsi alle diverse necessità. Sebbene questi dati siano intriganti, ulteriori indagini potrebbero fornire dati sempre più utili per la loro applicazione clinica nella medicina rigenerativa. Come prova di principio che le cellule staminali epiteliali hanno un potenziale intrinseco per la medicina rigenerativa che può essere sfruttato con una caratterizzazione più profonda, il mio gruppo è stato in grado di applicare, in vitro, un protocollo di terapia cellulare a un paziente affetto da un raro mosaicismo di sindrome EEC. Le HKL sembrano essere scaffold particolarmente attraenti (animal-free) per la ricostruzione a tutto spessore della cornea. Abbiamo già iniziato con il reclutamento di pazienti canini per valutare la trapiantabilità e la funzionalità di queste strutture organotipiche e, attraverso la collaborazione con diversi dipartimenti veterinari, stiamo creando una piccola coorte sulla quale iniziare con le prime prove di trapianto.