Mir-320a as a potential novel circulating biomarker of Arrhythmogenic Cardiomyopathy

Introduzione: La diagnosi di Cardiomiopatia Aritmogena (CA) risulta essere spesso una sfida per il cardiologo clinico e viene talvolta effettuata in ritardo rispetto all'insorgenza dei sintomi. Si basa sull’identificazione di criteri diagnostici ottenuti attraverso l’utilizzo di diverse indagini clinico-strumentali, talvolta invasive e tramite test genetici. Ad oggi nessun marcatore bioumorale circolante è stato validato e utilizzato quale criterio diagnostico. Abbiamo ipotizzato che i microRNA (miRNA) circolanti, già validati nella diagnosi di molte altre malattie cardiache (insufficienza cardiaca, infarto miocardico, fibrillazione atriale) possano essere utilizzati come potenziale strumento diagnostico nella CAVD. Obiettivi: 1. Eseguire uno screening di miRNA in campioni di plasma di soggetti maschi sani o affetti da CA. 2. Valutare la specificità e la sensibilità dei miRNA nel riconoscimento della CA. In particolare identificare i diversi livelli d’espressione dei miRNA plasmatici nei pazienti con CA rispetto ai controlli sani (CS) e/o ai pazienti con aritmie ventricolari a diversa eziologia (tachicardia ventricolare idiopatica (TVI) o conseguente a cardiopatia ischemica (CI). 3. Valutare la possibile correlazione tra l'espressione dei miRNA e la gravità della malattia espressa in termini di numerosità degli eventi aritmici maggiori, funzionalità ventricolare destra e sinistra e in termini di estensione della sostituzione fibro-adiposa ottenuta mediante mappaggio elettroanatomico e risonanza magnetica cardiaca (RMC). 4. Valutare come la differente espressione dei miRNA circolanti identificati possa regolare lo sviluppo e la progressione della sostituzione fibro-adiposa in colture di cellulle cardiache mesenchimali stromali (C-MSC). Metodi: Sono stati arruolati nello studio tutti i pazienti con aritmie ventricolari, riferiti all’Unità di Elettrofisiologia del Centro Cardiologico Monzino (Milano) per essere sottoposti ad ablazione transcatetere e controlli sani. Tutti i pazienti sono stati sottoposti a: - RMC per valutazione dei volumi e funzionalità del ventricolo destro e sinistro e per determinazione dell’estensione delle “scars”. - Mappaggio elettroanatomico intracavitario bipolare e unipolare (CARTO). - Biopsia endomiocardica, quando indicata per valutazione della presenza e l’estensione della sostituzione fibro-adiposa del ventricolo destro. - Prelievo di sangue venoso l'analisi molecolare di 320 miRNA. I campioni di sangue (5 ml) sono stati raccolti in provette EDTA e l'RNA totale è stato estratto dal plasma. L'espressione di ogni singolo miRNA è stata valutata utilizzando saggi TaqMan microRNA (Life Technologies) seguendo le istruzioni del produttore. L’espressione dei MiRNA validati è stata analizzata utilizzando GraphPad Prism versione 5.03 per Windows e riportati come media ± deviazione standard della media (SD). Le cellule stromali mesenchimali cardiache (C-MSC) sono state ottenute da un campione bioptico di pazienti con sospetta CA. Al fine di valutare il coinvolgimento C-MSC durante adipogenesi è stato eseguito un esperimento in vitro per simulare lo sviluppo della patologia. Risultati: 114 soggetti maschi sono stati arruolati nello studio: 35 soggetti affetti da CA, 35 soggetti sani, 20 affetti da TVI e 24 da CI. Il livello d’espressione di 368 miRNA circolanti è stato valutato su campioni di plasma di 6 soggetti (3 affetti da CA e soggetti sani). Di 150 miRNA espressi in tutti i campioni di plasma, 14 miRNA sono risultati regolati. Tra i 4 miRNA maggiormente regolati, il miR-320a è stato validato inizialmente mediante qRT-PCR nel plasma di 32 soggetti (16 controlli sani e 16 soggetti affetti da CA) In seguito abbiamo valutato l’espressione di miR-320a in tutti i soggetti dello studio. I livelli d’espressione del miR-320A sono risultati statisticamente inferiori nei soggetti affetti da CA rispetto ai controlli sani (0,42 ± 0,04, p = 0,008) con un valore di cut-off (ΔCt <-5.55) il miR-320a ha presentato una sensibilità del 65% e una specificità dell’ 80% nel discriminare I pazienti con CA. Non abbiamo trovato nessuna differenza statisticamente significativa nell’espressione di miR-320a tra soggetti sani e affetti da TVI (1,09 ± 0,5 p = ns) come tra soggetti sani e affetti da CI (0.74 ± 0.22 p = ns). Nei soggetti affetti da CA, non abbiamo trovato alcuna correlazione tra i livelli d’espressione di miR-320 a e il verificarsi di eventi aritmici maggiori così come con gli indici di funzionalità ventricolare. Una correlazione statisticamente significativa è stata riscontrata tra i livelli di espressione del miR-320a e la funzione ventricolare sinistra (FE)(r2=0.20 p<0.04). In 12 dei pazienti con CA abbiamo trovato un trend di significatività statistica tra i livelli di miR-320 a e le aree di “scar” al mappaggio elettroanatomico unipolari e la presenza di LGE (p=0,07). Dallo studio in vitro sulle C-MSC abbiamo evidenziato una ridotta espressione di miR-320 nelle cellule ottenute dai pazienti con CA rispetto alle cellule ottenute dagli altri soggetti (0,44 ± 0,08, p=ns) Conclusioni: Questo è il primo studio in cui sia stata valutata l’utilità diagnostica dei miRNA circolanti nella CA. I livelli plasmatici d’espressione del miR-320a sono costantemente più bassi nei soggetti affetti da CA rispetto a soggetti sani o con cardiopatia ischemica o affetti da tachicardia ventricolare idiopatica e si è dimostrato in grado di discriminare con una buona accuratezza i soggetti affetti da CA rispetto ai soggetti affetti da TVI. I nostri dati preliminari suggeriscono miR-320a quale potenziale marcatore bioumorale di CA e sembrerebbero evidenziare una correlazione inversa tra i livelli d’espressione di miR-320a e la gravità della patologia. La creazione di un modello cellulare di adipogenesi indotta in cellule mesenchimali stromali cardiache mediante regolazione di miR-320a potrebbe aprire la strada a futuri studi meccanicistici sul controllo epigenetico dell’adipogenesi nella CA.