IGHV1-69 as a promising candidate for the development of a shared immunotherapy to B-cell lymphomas

I Linfomi Non-Hodgkin a cellule-B (B-NHL) rappresentano un gruppo eterogeneo di patologie, ampiamente diffuse nel mondo e caratterizzate da frequenti ricadute in seguito a trattamenti standard o terapia con rituximab. Vaccini terapeutici che hanno come bersaglio l’Idiotipo (Id) dei B-NHL, costituiscono un approccio promettente nel mantenere la risposta completa indotta con trattamenti standard. Tuttavia, i vaccini idiotipici personalizzati rappresentano ancora un approccio terapeutico sperimentale e non approvato su larga scala, principalmente perché paziente-specifici e perché privi di marcatori attendibili per l’identificazione di pazienti elegibili e di risposta alla terapia. Ciononostante, la caratterizzazione molecolare di differenti istotipi di tumori di origine linfoide, ha rivelato la presenza di una serie di immunoglobuline stereotipate anche fra linfomi di diverso tipo. Su questi presupposti, abbiamo focalizzato la nostra attenzione sulla proteina IGHV1-69, frequentemente espressa in linfomi associati all’infezione da HCV, nella leucemia linfatica cronica (CLL) e in linfoproliferazioni associate ad auto-immunità, e abbiamo valutato in vitro l’immunogenicità di questa proteina. Inizialmente, abbiamo confrontato 70 sequenze relative alla proteina IGHV1-69 e ottenute da pazienti affetti da differenti B-NHLs o linfoproliferazioni pre-maligne, allo scopo di ideare una sequenza ottimizzata, caratterizzata dal maggior grado di similarità fra i tumori presi in esame, e pertanto priva della regione ipervariabile CDR3. All’interno di questa nuova sequenza, abbiamo identificato 13 epitopi potenzialmente riconoscibili da linfociti T citotossici (CTLs) nell’ambito di 7 alleli HLA di classe I, e abbiamo sintetizzato i corrispondenti pentameri (Pent). Tramite citofluorimetria a flusso abbiamo quindi valutato la presenza di risposte T-cellulari specifiche per gli epitopi derivati da IGHV1-69, in campioni di sangue periferico ottenuti da pazienti affetti da linfoproliferazioni esprimenti IGHV1-69 e da donatori sani. Abbiamo inoltre validato questi dati tramite saggi ELISPOT (Enzyme-linked immunosorbent spot) per l’identificazione del rilascio di IFN-γ. Infine abbiamo stimolato in vitro le risposte specifiche per IGHV1-69, inducendo i linfociti del sangue periferico (PBLs) di donatori sani e pazienti, attraverso diversi protocolli per la generazione di colture CTL epitopo-specifiche. E’ stato interessante osservare come nei campioni ottenuti da paziente la popolazione di linfociti T CD8+ positiva ai pentameri specifici per gli epitopi di IGHV1-69 sia risultata generalmente più numerosa della corrispondente popolazione osservata in donatori sani. Questo dato supporta l’esistenza di risposte memoria T cellulari nei confronti di IGHV1-69, almeno in alcune restrizioni HLA. Inoltre, nei campioni ottenuti da paziente le cellule T specifiche per gli epitopi di IGHV1-69 hanno rivelato in saggi ELISPOT un maggior rilascio di IFN-γ rispetto ai linfociti T specifici per epitopi virali. In aggiunta, stimolando parallelamente PBLs di donatori sani e pazienti, abbiamo ottenuto linee CTL peptide-specifiche, in grado di riconoscere debolmente, ma in modo specifico target caricati con il peptide d’interesse, soprattutto quando derivate da PBLs di pazienti. Inoltre, tramite l’utilizzo di antigen-presenting cells artificiali, prodotte allo scopo di indurre ed espandere linee CTL caratterizzare da bassa affinità nei confronti di antigeni tumorali, abbiamo anche generato cloni CTL specifici per un epitopo di IGHV1-69 a partire da linfociti T CD8+ di donatori. Infine, si è evidenziato che colture CTLs indotte in seguito a stimolo con epitopi derivanti da IGHV1-69, sono in grado di riconoscere in modo specifico una linea cellulare naturalmente esprimente IGHV1-69, suggerendo in questo modo che le risposte memoria T-cellulari specifiche per IGHV1-69, possano essere stimolate ed espanse a scopi terapeutici. Questi risultati dimostrano che IGHV1-69 costituisce un target potenziale per lo sviluppo di un vaccino Id applicabile su un sottogruppo di linfomi a cellule B. Inoltre, l’immunomonitoraggio tramite marcatura con multimeri (tetrameri o pentameri) e saggi ELISPOT potrebbe eludere almeno parzialmente i principali limiti degli attuali vaccini idiotipici, al fine di incrementare ulteriormente la loro efficacia clinica.