Optimization of light use efficiency in Nannochloropsis for biodiesel production

Attualmente la richiesta mondiale di energia viene in gran parte soddisfatta utilizzando combustibili fossili, primo tra tutti il petrolio. Nonostante sia facile supporre che anche nei prossimi decenni la produzione energetica derivante da fonti fossili sarà preponderante, già ora sono necessarie delle alternative: le riserve di petrolio sono limitate ed i costi di estrazione sono in continua crescita. Le fonti energetiche rinnovabili rappresentano una buona soluzione al problema energetico e per questo motivo stanno ricevendo una forte attenzione da parte dell'industria e dei centri di ricerca. Esistono diverse fonti di energia rinnovabile, tra queste gli organismi fotosintetici possono rappresentare un'alternativa promettente perché possono essere sfruttati per la produzione di diverse molecole utilizzabili come combustibili potendo generare etanolo, idrogeno e lipidi. I combustibili prodotti utilizzando organismi viventi sono chiamati biocarburanti e per la maggior parte sono ottenuti da coltivazioni di piante oleaginose come la soia, la palma e la colza. Queste coltivazioni tuttavia presentano anche molti lati negativi sia perché la loro produzione è esclusivamente stagionale sia perché il loro contenuto lipidico è pari al 5% della biomassa totale il che abbassa notevolmente la redditività di queste coltivazioni. È possibile superare queste limitazioni sfruttando altri tipi di microrganismi fotosintetici come microalghe. Alcune specie di alghe hanno, infatti , la capacità di accumulare grandi quantità di lipidi al loro interno e tali lipidi possono essere impiegati come materia prima per la produzione di biodiesel. Le microalghe sono gruppo molto vasto comprendente migliaia di differenti specie: la scelta dell’organismo adatto è un passo fondamentale. La microalga ideale dovrebbe essere capace di mantenere un elevato tasso di crescita sotto differenti intensità luminose ed avere la capacità di accumulare elevate quantità di lipidi. Parte di queste caratteristiche ideali sono state rilevate in Nannochloropsis gaditana, una microalga marina, diventata, non solo per il nostro gruppo di ricerca, l'organismo modello per il biodiesel. L'obiettivo generale di questo lavoro è indagare l'apparato fotosintetico di Nannochloropsis gaditana per ottimizzare l'efficienza nell'utilizzo della luce al fine di aumentare la produttività di lipidi. Infatti, come ampiamente descritto nel secondo capitolo, la luce fornisce l'energia a sostegno del metabolismo delle alghe e, di conseguenza, supporta anche la produzione di lipidi. Quindi l'energia luminosa disponibile deve essere sfruttata con la massima efficienza possibile per ottimizzare la produttività e rendere la coltivazione di microalghe su larga scala energeticamente ed economicamente sostenibile all’interno di fotobioreattori. In questo capitolo sono state studiate le basi molecolari e i fattori che influenzano l'efficienza della luce e il suo utilizzo per la produzione di biomassa. Vengono inoltre forniti esempi di come sia possibile migliorare la produttività nei fotobioreattori lavorando in modo sinergico sia a livello biotecnologico, modificando geneticamente l'organismo, sia a livello ingegneristico con il miglioramento del design del fotobioreattore e con il controllo della luce all'interno dello stesso. Nel terzo capitolo, viene studiato in dettaglio l'apparato fotosintetico di Nannochloropsis, il quale risulta caratterizzato dalla presenza della sola clorofilla a, mentre violaxantina e vaucheriaxanthina-estere sono invece i carotenoidi più abbondanti. L'apparato fotosintetico è stato analizzato purificando i tilacoidi e isolando i diversi complessi attraverso una blanda solubilizzazione. I risultati della caratterizzazione biochimica e spettroscopica hanno dimostrato che le antenne (chiamate VCP, Violaxanthin Chlorophyll binding Protein) del fotosistema II (PSII) sono debolmente legate al centro di reazione, mentre questa associazione risulta più forte nel caso del fotosistema I (PSI), dove i supercomplessi centro di reazione-antenne non vengono intaccati dalla purificazione. Questo tipo di organizzazione del fotosistema I non è presente solo in Nannochloropsis, ma risulta essere conservata anche in diversi altri eucarioti fotosintetici, anche se questi taxa sono evolutivamente distanti. Il risultato ottenuto suggerisce una forte pressione evolutiva per la presenza di un'associazione stabile tra il complessi antenna e il centro di reazione nel caso di PSI ma non nel caso di PSII. Una possibile spiegazione viene data dal fatto che il PSII è coinvolto in diversi meccanismi regolatori che richiedono un legame flessibile tra complessi antenna e il centro di reazione, lasciando quindi la possibilità di modulare questa associazione secondo gli stimoli ambientali. Il centro di reazione del PSI, al contrario, si caratterizza per essere stabile per quanto riguarda lo stress da alta luce e subire un turnover molto basso. Nonostante sia stato dimostrato che anche il complesso antenna del PSI subisce delle forme di regolazione in presenza di stimoli ambientali molto forti, le attuali conoscenze suggeriscono che i meccanismi che incidono sui complessi antenna del PSI siano meno invasivi rispetto a quelli del PSII e non richiedano la continua modulazione della sua interazione con il centro di reazione del PSI e siano quindi compatibili con una forte associazione con il centro di reazione. Dopo aver indagato l'apparato fotosintetico di Nannochloropsis, nel quarto capitolo, sono state studiate le sequenze delle proteine antenna ed è stata fatta un'analisi del proteoma dei complessi antenna, del PSI e del PSII. L'analisi filogenetica delle sequenze antenna, identificate nel genoma di Nannochloropsis, ha permesso la loro classificazione in sei diversi sottogruppi. L' analisi preliminare del proteoma ha evidenziato l'esistenza di specifiche proteine antenna legate al PSI che formano i supercomplessi del PSI. Il quinto capitolo è dedicato alle diverse strategie impiegate per l'ottimizzazione biotecnologica di Nannochloropsis. Nonostante Nannochloropsis sia considerato l'organismo modello per la produzione di biocarburanti, i protocolli per la manipolazione genetica di questa specie sono ancora in via sviluppo e solo recentemente sono state rese note le sequenze del genoma, rendendo possibile progettare protocolli specifici per il miglioramento biotecnologico di questa microalga. In questo capitolo sono stati testati due metodi differenti, la ricombinazione omologa e la mutagenesi chimica, su colture di Nannochloropsis per generare e isolare possibili mutanti. I risultati ottenuti hanno evidenziato che Nannochloropsis non è in grado di effettuare la ricombinazione omologa con alta efficienza e la mutagenesi chimica, rappresenta per ora il metodo più efficace per migliorare i ceppi di Nannochloropsis. La fotosintesi è un fenomeno complesso, finemente regolato sulla base delle condizioni ambientali e ben lungi dall'essere completamente compreso. Tale comprensione è però fondamentale nella prospettiva della produzione di biocarburanti da alghe al fine di rendere le strategie di manipolazione genetica più efficaci. Uno dei target principali in questo campo è il ciclo delle xantofille, un meccanismo di fotoprotezione che viene attivato in condizioni di forte illuminazione, presente nella maggior parte eucarioti foto sintetici, compresa Nannochloropsis. Nel sesto capitolo viene considerata l'ipotesi che questo meccanismo sia regolato in base allo stato redox. Lo studio è stato eseguito sul dominio N-terminale ricco in cisteine della VDE di A. thaliana; com'è dimostrato nel capitolo, i residui analizzati sono ben conservati in tutte le altre specie e quindi le conclusioni tratte sono molto probabilmente valide anche per la VDE di Nannochloropsis. I risultati hanno rivelato che le cisteine sono fondamentali per l'attività enzimatica della VDE e tutti questi residui, tranne uno, sono coinvolti in ponti disolfuro. La titolazione redox, inoltre, ha mostrato una forte dipendenza dell'attività dal potenziale redox, disegnando uno scenario in cui la regolamentazione redox non risulta particolarmente adatta per una fine regolazione dell'attività della VDE. Nell'appendice 1, le tecniche avanzate di EPR sono state impiegate al fine di indagare la presenza del meccanismo fotoprotettivo basato su triplet-triplet energy transfer (TTET) nelle antenne (VCP) di Nannochloropsis. I risultati ottenuti mostrano una forte somiglianza in termini di popolazione dello stato di tripletto tra VCP, FCP di diatomee e LHCII di piante superiori. Nonostante queste proteine antenna abbiano sequenze diverse e leghino pigmenti differenti, i risultati suggeriscono che in tutti i membri della superfamiglia LHC sussiste un core costituito da due carotenoidi, il quale è circondato da cinque molecole di clorofilla a. Questa organizzazione strutturale conservata gioca una particolare funzione fotoprotettiva fondamentale nel quenching dei tripletti di Chl.