REGULATION OF AUTOPHAGY AND THE UBIQUITIN- PROTEASOME SYSTEM BY THE FoxO TRANSCRIPTIONAL NETWORK DURING MUSCLE ATROPHY

Il muscolo scheletrico è in grado di adattare la sua massa in risposta all’ esercizio fisico, al metabolismo e a gli ormoni. Il controllo della massa muscolare dipende quindi da un coordinato equilibrio tra sintesi e degradazione proteica. L’esercizio fisico e gli stimoli anabolici spostano questo equilibrio verso la sintesi proteica, la quale porta ad un aumento delle dimensioni delle fibre muscolari attraverso un processo noto come ipertrofia. Al contrario, in condizioni cataboliche, la degradazione proteica aumenta rispetto alla sintesi portando a debolezza muscolare e atrofia. La perdita di massa e forza sono una conseguenza di diverse condizioni patalogiche come il disuso, la denervazione, l’ immobilizzazione, la sepsi, ustioni, cancro, AIDS, diabete ed invecchiamento. L’atrofia muscolare è un processo catabolico che richiede l’attivazione di specifiche vie di segnale e programmi trascrizionali. Studi di espressione genica hanno identificato un set di geni, chiamati atrogenes (geni correlati all’atrofia), che sono comunemente up-regolati e down- regolati in differenti condizioni cataboliche. (Bodine et al., 2001; Gomes et al., 2001; Lecker et al., 2004; Sacheck et al., 2007; Sandri et al., 2004). Questi geni codificano per enzimi che catalizzano importanti step nei principali pathway cellulari come il sistema autofagico lisosomiale, il sistema ubiquitina-proteasoma, stress del reticolo, sistemi di riparazione del DNA ed enzimi che regolano attività mitocondriali. La crescita muscolare è regolata dalla via di segnale IGF1-AKT-mTOR-FoxO (Sandri, 2013). L’ attività dei fattori trascrizionali FoxO è quindi abolita durante la crescita muscolare tramite l’ attivazione della chinasi AKT. In assenza però di fattori di crescita come IGF1 o insulina, la chinasi AKT non è attivata e risulta dunque incapace di bloccare FoxO che può traslocare nel nucleo e legare i promotori dei suoi geni target (Sandri et al., 2004). L’ attivazione dei fattori FoxO promuove l’espressione di essenziali ubiquitine ligasi legate all’ atrofia atrogin-1 e MuRF-1 e porta ad una drammatica perdita della massa muscolare (Kamei et al., 2004; Sandri et al., 2004), inoltre è noto che l’autofagia e l’espressione di alcuni dei geni correlati all’ atrofia sono sotto il controllo del fattore trascrizionale FoxO3 (Mammucari et al., 2007; Zhao et al., 2007). I fattori FoxO coordinano i due principali sistemi proteolitici della cellula: il sistema autofagico lisosomiale e il sistema ubiquitina proteasoma. Tuttavia, l’ attivazione degli atrogenes controllati trascrizionalmente da FoxO non è sufficiente, da sola, a giustificare la completa perdita della massa muscolare; tra gli atrogenes vi sono dunque diversi altri geni che giocano un ruolo di potenziale interesse nella regolazione nell’ atrofia muscolare la cui funzione però, è ancora sconosciuta. Per questo motivo, nel mio progetto di dottorato, abbiamo caratterizzato attraverso la metodica del loss of function il ruolo dei fattori trascrizionali FoxO nella regolazione genica e nell’ adattamento del muscolo scheletrico in condizioni cataboliche. La famiglia dei fattori trascrizionali FoxO comprende 4 isoforme FoxO1, FoxO3, FoxO4 e FoxO6. Per eliminare simultaneamente i fattori FoxO specificamente nel muscolo abbiamo generato dei topi knock-out muscolo specifici per i fattori FoxO1,3,4 che sono principalmente espressi nel muscolo. Questi animali sono risultati essere vitali, ed apparentemente indistinguibili dai loro topi di controllo. Per caratterizzare il ruolo dei fattori Foxo1,3,4 nel muscolo scheletrico, abbiamo analizzato il fenotipo dei topi knock-out in condizioni in cui vi era perdita di massa. Inizialmente abbiamo utilizzato il digiuno, una delle condizioni in cui FoxO è attivo e trasloca nel nucleo dove trascrive i suoi geni target, come modello di atrofia. I topi FoxO1,3,4 erano completamente protetti dalla perdita di massa e forza in seguito al digiuno, ed inoltre la delezione dei fattori FoxO portava ad un completo blocco del flusso autofagico durante il digiuno. Per determinare se il ruolo dei fattori FoxO è critico nelle differenti condizioni di atrofia, abbiamo deciso di utilizzare la denervazione come altro modello di perdita di massa muscolare. La quantificazione dell’ area delle fibre mostrava in questo caso una parziale protezione dall’ atrofia suggerendo che i fattori FoxO sono necessari nel promuovere la perdita di massa ma il loro coinvolgimento nel programma atrofico dipende dal dipo di condizione catabolica. Com’è noto l’ atrofia muscolare è caratterizzata dall’ attivazione di uno specifico programma genico, dunque, abbiamo per prima cosa identificato i geni regolati trascrizionalmente da FoxO attraverso un’ analisi di gene expression profiling condotta su topi FoxO1,3,4 knock-out e controlli , alimentati e a digiuno. Abbiamo quindi paragonato la lista dei geni regolati da FoxO con la lista degli atrogenes e abbiamo trovato che 29 di 63 atrogenes non erano espressi nei muscoli dei topi FoxO knock-out durante il digiuno. Degno di nota è che la lista dei geni controllati da FoxO nella denervazione e nel digiuno non era completamente sovrapponibile confermando che i fattori FoxO erano maggiormente coinvolti nel processo atrofico in condizioni di carenza di nutrienti. Infine abbiamo identificato nuove ubiquitine ligasi regolate dai fattori FoxO tra cui MUSA1, recentemente identificata nel nostro laboratorio, e una nuova unquitina ligasi a cui abbiamo dato il nome di SMART (Specific of Muscle Atrophy and Regulated by Transcription). Attraverso esperimenti di immunoprecipitazione abbiamo confermato che SMART apparteneva alla famiglia delle E3 ubiquitina ligasi SCF dal momento che formava un complesso con le altre componenti Skp1, Cullin1 e Roc1 . Successivamente per validare l’ipotesi che SMART avesse un ruolo nel promuovere l’ atrofia muscolare abbiamo bloccato la sua espressione nei muscoli tibiali di topi innervati e denervati e abbiamo constatato che il blocco di SMART proteggeva i muscoli denervati dall’ altrofia. Pertanto, SMART rappresenta un nuovo gene critico per il programma atrofico. In conclusione, questo progetto di dottorato identifica il ruolo di FoxO nella perdita di massa muscolare. Queste informazioni potrebbero risultare utili per combattere l’ atrofia muscolare in molte malattie sistemiche suggerendo nuove strategie farmacologiche che blocchino la perdita di massa muscolare.