Functional and structural analysis of [NiFe]- and [FeFe]-hydrogenases, the key enzymes for biohydrogen production

Negli ultimi anni il problema della crisi energetica ha assunto un’importanza tale da spingere la ricerca verso fonti di energia diverse dai combustibili fossili. In questo ambito l’idrogeno molecolare rappresenta una valida alternativa in quanto è una risorsa di energia rinnovabile e pulita dal momento che l’acqua è l’unico sottoprodotto della sua combustione. Le attuali tecniche di produzione dell’idrogeno, tuttavia, necessitano di miglioramenti in termini di rendimento e di costo. Una via promettente è quella biologica, che sfrutta microorganismi fotosintetici dai quali, in opportune condizioni, producono idrogeno solo con acqua e luce solare. Esistono due principali classi di enzimi coinvolti nel metabolismo dell’idrogeno: le [FeFe]- e le [NiFe]-idrogenasi, entrambe catalizzano la reazione reversibile 2H+ + 2e- ↔ H2, ma le [FeFe]-idrogenasi risultano più interessanti perchè presentano un’attività specifica superiore a quella delle [NiFe]-idrogenasi. Nonostante queste due idrogenasi abbiano sia strutture tridimensionali che sequenze differenti, e siano filogeneticamente distinte, rappresentano un chiaro esempio di evoluzione convergente in quanto, oltre a catalizzare la stessa reazione, hanno un sito attivo molto simile. L’assemblaggio di quest’ultimo è in entrambi i casi un processo complesso: nel caso delle [NiFe]-idrogenasi è regolato da sei proteine (HypA-F) ed è stato ampiamente studiato e caratterizzato. Il meccanismo di maturazione delle [FeFe]-idrogenasi, invece, coinvolge tre maturasi, HydE, HydF, HydG e non è ancora stato chiarito completamente. In particolare HydF, la cui struttura 3D è stata risolta nel nostro laboratorio (Cendron L. et al., 2011), è una proteina ad attività GTPasica e svolge un ruolo centrale in questo processo. Tuttavia, molti dettagli mancano ancora per definire con precisione la sua funzione, anche a causa del fatto che la sua struttura è stata risolta in forma apo, completamente priva di cofattori. Questa lacuna rappresenta un limite per lo sviluppo di biotecnologie che permetterebbero di esprimere in vitro [FeFe]-idrogenasi ricombinanti in forma cataliticamente attiva. Un altro tema irrisolto riguarda il ruolo biologico delle idrogenasi, dal momento che questi enzimi vengono inibiti dall’ossigeno, ma curiosamente sono espressi da microrganismi che vivono prevalentemente in condizioni aerobiche. Nel corso del Dottorato ho concentrato il mio lavoro sperimentale principalmente su due argomenti: il ruolo fisiologico della [NiFe]-idrogenasi nel cianobatterio Synechocystis sp. PCC 6803; la caratterizzazione biochimica del dominio GTPasico di HydF. Synechocystis sp PCC 6803, diversamente da altri ceppi di cianobatteri, possiede solamente una [NiFe]-idrogenasi bidirezionale. Questo enzima è composto da cinque subunità combinate in due unità funzionali: la porzione idrogenasica, chiamata HoxYH, che ospita il sito attivo, e la porzione diaforasica, chiamata HoxEFU, che probabilmente agisce come partner redox per il subcomplesso catalitico. La funzione fisiologica di questo enzima è ancora oggetto di discussione: il consenso generale è che può giocare un ruolo soltanto in condizioni di crescita specifiche e/o transitorie. È interessante notare che, pur essendo completamente inattiva in presenza di ossigeno, la proteina Hox è costitutivamente espressa in Synechocystis sia in anaerobiosi che in aerobiosi, suggerendo una sua funzione aggiuntiva, oltre al coinvolgimento nel metabolismo dell'idrogeno, perlomeno in condizioni selettive. Ho generato diversi ceppi mutanti di Synechocystis, eliminando singoli geni hox e hyp o combinazioni di essi, codificanti rispettivamente per la subunità idrogenasica e per le proteine coinvolte nell'assemblaggio del sito attivo, e ho analizzato il loro fenotipo in condizioni di crescita al buio completo e prolungato in aerobiosi e anaerobiosi, alle quali i cianobatteri sono spesso esposti in natura. Abbiamo riscontrato che il ceppo mutante knock out ΔHoxEFUYH, privo dell'intero operone hox, ha una notevole riduzione della crescita se confrontato con il ceppo wild type. Poiché la funzione idrogenasica della proteina Hox è immediatamente inattivata dall'ossigeno, abbiamo supposto che il fenotipo osservato non fosse collegato alla sua porzione YH. Questa ipotesi è stata esplorata eliminando i geni codificanti i) per le proteine HypA e HypB, coinvolte nell’ultima fase della maturazione idrogenasi e ii) per la porzione HoxYH, e valutando il loro comportamento in queste condizioni di stress ambientale. Abbiamo evidenziato che un sito attivo funzionale e correttamente assemblato non è indispensabile per conferire a Synechocystis la capacità di affrontare l’oscurità prolungata. Per caratterizzare ulteriormente il ceppo wild type e il mutante ΔHoxEFUYH cresciuti in queste condizioni abbiamo effettuato un’analisi proteomica quantitativa. L’esame delle proteine identificate ha dimostrato che quasi tutte le subunità idrofiliche del complesso I della catena respiratoria hanno ridotti livelli di espressione. Questi risultati sono coerenti con precedenti studi indipendenti in cui la [NiFe]-idrogenasi è stata funzionalmente associata al complesso I (Cournac L. et al., 2004) e indicherebbero che l'intero flusso di elettroni è alterato quando Synechocystis cresce in buio prolungato, una condizione in cui sia la fotosintesi che la respirazione risultano compromesse. Pertanto, l’esito delle nostre ricerche potrebbe fornire una prova molecolare a supporto dell’ipotesi che la [NiFe]-idrogenasi sia funzionalmente correlata alla catena respiratoria, e più in generale far luce sull'espressione e sulla funzione dell’enzima in condizioni aerobiche. La proteina HydF possiede tre diversi domini: uno coinvolto nel legame e idrolisi del GTP, uno di dimerizzazione e uno per il legame del centro FeS. Nella seconda parte del mio progetto abbiamo studiato le possibili variazioni conformazionali indotte dal legame del GTP, esprimendo in Escherichia coli il solo dominio di legame del GTP della proteina ricombinante HydF di Thermotoga neapolitana. In questo dominio abbiamo mutato dei siti ritenuti interessanti per la nostra analisi inserendo delle cisteine, che successivamente sono state marcate con lo spin-label MTSSL nitrossido, selettivo per i tioli. Questa sonda, ampiamente utilizzata in spettroscopia EPR, ci ha permesso in primo luogo di studiare la mobilità locale dei nitrossidi in ogni singolo sito mutato; in seguito, mediante spettroscopia PELDOR, abbiamo analizzato delle coppie di residui marcati con la stessa tecnica. Abbiamo scoperto che il legame del nucleotide non induce grandi effetti conformazionali all'interno del dominio isolato. Tuttavia, sono state osservate piccole variazioni nelle distanze tra i doppi residui marcati che potrebbero avere effetti diffusi e riflettersi nella conformazione di HydF. I risultati ottenuti potrebbero far chiarezza sul ruolo del legame del GTP a HydF e sulle sue implicazioni nelle interazioni di questa proteina con le altre due maturasi. Con questo studio abbiamo cercato di ampliare le conoscenze sulla struttura e sulla funzione delle idrogenasi per acquisire una maggiore comprensione dei meccanismi alla base della loro attività catalitica e dare un contributo per la messa a punto di sistemi biomimetici basati su questi enzimi, in cui massimizzare la produzione di H2