DNA, variations on the theme

Il dogma fondante della biologia molecolare afferma che le informazioni genetiche sono decodificate attraverso un ordinato flusso logico, che parte dal DNA e passando attraverso il RNA arriva alla sintesi proteica. Per lungo tempo, all’interno di questo assunto, il DNA è stato esclusivamente considerato come il deposito biochimico delle informazioni genetiche. Con un ottica totalmente differente, in questo lavoro di tesi di dottorato presenterò tre aspetti, differenti ma complementari dell’intero repertorio funzionale del DNA. La prima sezione di questa tesi è rivolta ad un dettagliato studio degli aptameri leganti la trombina, ovvero sequenze non fisiologiche di DNA capaci di riconoscere selettivamente il target proteico in funzione di una specifica conformazione formata da quartetti di polideossiguanosine. Mediante una precisa caratterizzazione biofisica dei polimorfismi strutturali e dei profili di legame abbiamo potuto proporre delle solide ipotesi sul ruolo degli elementi modulari che ne compongono l’architettura molecolare, al fine di razionalizzare ed eventualmente incrementarne la capacità di riconoscimento del substrato proteico. Diversamente, porzioni di DNA capaci di autoassemblarsi in quartetti di guanosina sono state identificate all’interno del genoma umano. Alcune tra queste sono state descritte come straordinari interruttori biochimici capaci di regolare i processi tumorali. Nello specifico, l’espressione dell’oncogene c-Myc è fortemente controllata attraverso la formazione di strutture di DNA non canoniche all’interno del suo promotore. Questo equilibrio conformazionale del promotore tra una forma inattiva trascrizionalmente (struttura a quartetti di guanosina) ed una attiva (la canonica forma a doppia elica) è assistito e modulato da svariate proteine nucleari. Nella seconda parte del mio lavoro di tesi presenterò uno studio inerente all’espressione eterologa, la purificazione proteica del prodotto ricombinante e la caratterizzazione biochimica dei domini funzionali della nucleolina umana, una proteina nucleolare capace di inibire la trascrizione dell’oncogene c-Myc attraverso un peculiare riconoscimento del suo promotore nella sua forma silente. Questo approccio è stato perseguito al fine di porre le prime basi per l’identificazione del meccanismo di riconoscimento proteina – DNA, fortemente implicato nella soppressione tumorale. Anche se rivoluzionaria, l’idea che le informazioni genetiche siano codificate solamente all’interno della sequenza del DNA, secondo un meccanismo che contempla le proteine solo come “lettori” di questo codice, appare un concetto decisamente desueto. Il DNA cromosomiale, infatti, è organizzato su strutture proteiche (istoni) per le quali è stato esclusa una funzione esclusivamente “strutturale”. E’ stato dimostrato, infatti, che tali proteine sono soggette ad una serie di modifiche post trasduzionali che regolano attivamente l’attivazione e l’inibizione della trascrizione del DNA. Nell’ultima sezione presenterò uno studio finalizzato a chiarire i dettagli molecolari del riconoscimento tra un frammento istonico e i domini funzionali dell’effettore atORC1b (origin recognition complex 1b di arabidopsis thaliana). L’identificazione dei meccanismi molecolari mediante i quali distinti moduli proteici riconoscono le specifiche modificazioni istoniche rappresenta un passaggio chiave nella comprensione di fondamentali processi cellulari come la trascrizione, la ricombinazione cromosomiale e la riparazione del DNA. Nello specifico, il nostro studio ha evidenziato come i domini PHD e BAH dell’ORC1b, opportunamente combinati, possono agire come moduli di lettura del frammento N-terminale dell’istone 3 nella sua specifica forma non metilata. Tale evidenza, per la prima volta, dimostra una correlazione diretta tra il grado di metilazione dell’istone e il ruolo epigenetico dell’ORC1b, precedentemente noto come regolatore indiretto della trascrizione solamente in funzione di interazione specifiche con fattori eterocromatinici.