Characterization of molecular pathways involved in acute and acute-on-chronic liver disease

Introduzione: Lo scompenso acuto in cirrosi è definito come la progressione acuta di una o più gravi complicanze della patologia epatica ed è la principale causa di ospedalizzazione nei pazienti con cirrosi. L'insufficienza epatica acuta su cronica (ACLF) è caratterizzata da uno scompenso acuto della cirrosi, da danno d'organo e da un elevato tasso di mortalità a 28 giorni. L'ACLF è caratterizzato da infiammazione sistemica e l'outcome infausto è strettamente associato con l'eccessiva risposta infiammatoria che si attiva nel paziente. L'inflammasoma è un complesso multi-proteico che attiva, mediante taglio proteolitico, citochine pro-infiammatorie come IL-1β e IL-18. Queste, hanno un ruolo nello sviluppo della patologia epatica. Le vescicole extracellulari (EVs) sono coinvolte in molti processi biologici importanti, sia fisiologici che patologici. Il processo di secrezione delle EVs da diversi tipi di cellule e la loro azione nel modulare l'avanzamento della patogenesi nella malattia epatica, non sono ancora completamente chiariti. Scopo: Lo scopo di questo studio è caratterizzare la via del segnale coinvolta nello scompenso acuto della cirrosi e dell'insufficienza epatica acuta-su-cronica attraverso: la caratterizzazione del profilo infiammatorio dei pazienti arruolati, lo studio in vitro dell'effetto citotossico nel plasma dei pazienti nelle cellule tubulari renali (RTC), lo studio dell'espressione dell'inflammasoma nelle cellule trattate e nelle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) estratte dai pazienti, la caratterizzazione delle EVs estratte dal plasma dei pazienti arruolati e lo studio del loro effetto in vitro su colture di RTC. Materiali e Metodi: sono stati arruolati pazienti con cirrosi compensata, scompenso acuto in cirrosi, insufficienza epatica acuta-su-cronica e una popolazione di volontari sani come controllo. I livelli plasmatici di IL-6, IL-1β e IL-18 sono stati misurati con kit ELISA. L'effetto citotossico del plasma nelle RTC è stato testato con il kit costituito da annexina V e propidio ioduro. Il livello di espressione delle molecole dell'inflammasoma è stato determinato sia nelle cellule stimolate con il plasma, sia nei PBMC estratti dai pazienti, attraverso Real Time Poly Chain Reaction (RT-PCR). Le EVs plasmatiche sono state estratte mediante ultracentrifugazione e la loro concentrazione determinata con il Nanosight. La loro caratterizzazione è stata eseguita mediante analisi al FACS. L'effetto citotossico delle EVs sulle RTC è stato determinato mediante saggio XTT. Risultati: I livelli plasmatici delle citochine pro-infiammatorie, misurati nei primi pazienti arruolati, non mostra differenze tra i gruppi di pazienti con cirrosi compensata, scompensata e insufficienza epatica acuta-su-cronica. Anche la vitalità e la morte cellulare nelle colture stimolate con i plasma dei pazienti arruolati non hanno mostrato un profilo peculiare dei gruppi testati e non è stata riscontrata attivazione della trascrizione delle molecole dell'inflammasoma. L'espressione del Tool-like receptor 2 (TLR-2) nei PBMC si è dimostrata significativamente elevata nei pazienti con cirrosi compensata rispetto a quelli con scompenso acuto (p=0,036). Aggiungendo albumina al mezzo di coltura cellulare si è notata una riduzione dell'effetto citotossico del plasma dei pazienti nelle RTC. La concentrazione plasmatica di EVs risulta maggiore nei pazienti con insufficienza epatica acuta-su-cronica rispetto ai controlli sani. Le vescicole non esprimono i marcatori tipici piastrinici (CD41 e CD42b) e monocitari (CD14) sulla loro superficie ma esprimono il marcatore dell'epitelio attivato da piastrine (CD62E). I livelli di CD62E sono significativamente elevati nei pazienti con insufficienza eparica acuta-su-cronica rispetto ai controlli sani e ai pazienti con cirrosi compensata (p=0,0041 e p=0,0111, rispettivamente). I livelli di CD40L sono significativamente elevati in tutti i gruppi di pazienti rispetto ai controlli sani (p<0,02). Le EVs isolate dei pazienti con insufficienza epatica acuta-su-cronica hanno un effetto citotossico superiore rispetto a quelle dei controlli sani e dei pazienti con cirrosi compensata nelle RTC (p<0,0001). Le cellule incubate con le EVs da pazienti con scompenso acuto in cirrosi e insufficienza epatica acuta-su-cronica vanno incontro ad apoptosi (p<0,0001), a produzione massiccia di ROS (p<0,0001), alla perdita della capacità di internalizzare l'albumina (p<0,0001) e alla riduzione dell'espressione di Zonula Occludens-1 (ZO-1) (p=0,0166) rispetto ai soggetti sani e ai pazienti con cirrosi compensata. Non si osserva invece un cambiamento nell'espressione cellulare di megalina e PGC1α. Conclusioni: Il ruolo delle EVs nella cirrosi scompensata necessita di essere approfondito perché potrebbero rappresentare il veicolo su cui viaggiano i mediatori del danno d’organo extraepatico.