Aspetti di genetica molecolare e possibili implicazioni terapeutiche nei tumori corticosurrenalici

Presupposti dello studio. I più comuni tumori corticali della ghiandola surrenalica (ACT) sono tumori benigni definiti adenomi corticosurrenalici (ACA) con una incidenza stimata di circa 7,3%. I tumori maligni, i carcinomi corticosurrenalici (ACC), sono invece rare neoplasie endocrine, con prognosi infausta ed incidenza di circa 1-2 casi per milione. I trattamenti per l’ACC sono inefficaci nella maggior parte dei casi ed attualmente si basano sull’uso di mitotane (o,p’DDD) con o senza i tradizionali agenti chemioterapici. Poiché le prognosi di ACA o di ACC sono estremamente differenti è importante differenziare queste due tipologie di tumore. Numerosi tumori attraverso il processo di angiogenesi stimolano la crescita dei vasi ematici dell’ospite. Recentemente è stata osservata una over-espressione del fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF) negli ACC ed i recettori di VEGF (VEGFR-1 e VEGFR-2) trovati anch’essi sulle cellule tumorali, suggeriscono un possibile effetto autocrino di VEGF per la crescita cellulare. Il farmaco sorafenib, un inibitore multichinasico, inibisce la fosforilazione di VEGFR-2 ed induce in vivo l’arresto della crescita di alcuni tumori. Il farmaco everolimus, analogo della rapamicina, inibisce mTOR coinvolto nella sopravvivenza cellulare e situato valle di VEGFR-2; è inoltre in grado bloccare la produzione di fattori pro-angiogenici in molti tumori neuroendocrini. Ad oggi, le alterazioni genetiche note che colpiscono gli ACT sono limitate ed inoltre nella tumorigenesi corticosurrenalica sono coinvolte una grande varietà di vie del segnale, in particolar modo la via del segnale di Ras/Raf/MEK/ERK e la via di Wnt/β-catenina risultano spesso alterate. Un’alterazione frequentemente riscontrata negli ACT è l’attivazione costitutiva della β-catenina, una molecola multifunzionale coinvolta anche nei processi di adesione cellulare assieme alle caderine (E-caderina ed N-caderina). Le caderine sembrano essere coinvolte nello sviluppo di molti carcinomi, ma le informazioni riguardanti la loro espressione negli ACT è molto limitata. Scopo. L’obbiettivo dello studio è stato quello di: a) valutare l’espressione di VEGF, VEGFR-1 e VEGFR-2 nei tessuti surrenalici normali e/o tumorali; b) esaminare l’effetto dei due farmaci, sorafenib ed everolimus, in vitro sulla vitalità cellulare, sull’apoptosi e su alcune pathways cellulari in linee stabilizzate (H295R, SW13), in colture primarie di ACT ed in vivo in modelli murini xenotrapiantati; c) analizzare la presenza di alterazioni geniche nei componenti chiave della via del segnale di Ras/Raf/MEK/ERK (studiando i geni BRAF, H-RAS, K-RAS, N-RAS) e nella via del segnale di Wnt/β-catenina (valutando i geni CTNNB1 e AXIN-2) ed indagare l’espressione della β-catenina in relazione alle molecole di adesione cellulare E-caderina ed N-caderina. Materiali e Metodi. Sono stati raccolti 24 carcinomi corticosurrenalici (adrenocortical carcinoma, ACC), 37 adenomi secernenti aldosterone (aldosterone producing adenoma, APA), 28 adenomi secernenti cortisolo (cortisol producing adenoma, CPA), 6 adenomi non secernenti (non-secreting adenoma, NSA) e 8 campioni di surrene normale (normal adrenal, NA). L’espressione genica di VEGF e dei suoi recettori (VEGFR-1 e VEGFR-2) è stata valutata in 63 ACT tramite real-time PCR. Nelle linee cellulari (SW13 e H295R) e nelle colture primarie corticosurrenaliche, attraverso il test MTT è stata osservata la vitalità cellulare incubando con sorafenib ed everolimus in un range di concentrazioni da 10 μM a 0,1 nM. In microscopia a fluorescenza (TUNEL) e dall’analisi citofluorimetrica (Anessina V) è stato valutato il grado di apoptosi indotto dai farmaci e tramite western blotting è stato analizzato il loro possibile coinvolgimento nelle vie di PI(3)K/Akt/mTOR e di Ras/Raf/MEK/ERK. Gli effetti dei farmaci, da soli o in combinazione, sono stati testati poi in vivo in modelli murini di ACC xenotrapiantati con cellule H295R ed SW13. Attraverso l’analisi di high resolution melting (HRM) abbiamo ricercato in 95 ACT la presenza di mutazioni attivanti nei geni BRAF (esoni 11 e 15), H-RAS (esoni 2 e 3), N-RAS (esoni 2 e 3), K-RAS (esoni 2 e 3), CTNNB1 (esone 3), AXIN2 (esone 7). I campioni aventi curve di melting dubbie o alterate sono stati sottoposti tutti al sequenziamento. Infine, è stata valutata in 68 ACT l’espressione genica di β-catenina, N-caderina ed E-caderina attraverso le tecniche di real-time PCR e di immunoistochimica (IHC). Risultati. Sia i tessuti corticosurrenalici normali che tumorali esprimono VEGF, VEGFR-1, VEGFR-2. Rispetto ai surreni normali, una significativa over-espressione di VEGF è stata osservata in circa il 65% (12/18) (P = 0.049) degli ACC analizzati ed in circa il 61% (20/33) (P = 0.025) degli APA. Nella valutazione della vitalità cellulare le cellule SW13 ed H295R rispondono in modo dose-dipendente ai farmaci sorafenib ed everolimus mentre in fluorescenza ed in citofluorimetria è stato osservato un effetto apoptotico. Mediante western, sorafenib induce una completa diminuzione della fosforilazione di Akt, ERK1/2 e P70S6K mentre everolimus, abolisce totalmente la fosforilazione di p-P70S6K. Delle 8 colture primarie sottoposte ai farmaci, 3 carcinomi e 3 adenomi rispondono in modo significativo sia al trattamento con sorafenib che all’everolimus, mentre 2 casi di ACC sono resistenti ad entrambi i farmaci. In vivo è stata osservata una significativa riduzione della massa tumorale ed un aumento della sopravvivenza mediana soprattutto nei topi sottoposti al trattamento farmacologico combinato. Attraverso le indagini in HRM sono state riscontate alcune alterazioni nei componenti della via del segnale di Ras/Raf/MEK/ERK: 2 ACC con mutazioni nel gene BRAF e 1 APA, 1 CPA e 2 ACC con mutazioni nel gene H-RAS. Per quanto riguarda l’indagine genetica della via del segnale di Wnt/β-catenina sono state osservate 18 alterazioni nel gene CTNNB1 (5 APA, 6 CPA, 2 NSA, 5 ACC) ed una sola mutazione nel gene AXIN2 nelle cellule H295R. In RT-PCR l’espressione di β-catenina è over-espressa in circa 50% degli ACC (12/24) ed in circa il 51% degli ACA (24/47) mentre in IHC circa il 47% degli ACC (7/15) ed il 33% degli ACA (11/33) presenta un notevole accumulo citoplasmatico e/o nucleare di β-catenina. In tutti gli ACT non è stata rilevata l’espressione di E-caderina, mentre per quanto riguarda N-caderina, in RT-PCR circa il 75% degli ACC (18/24) ed il 60% degli ACA (28/47) possiedono una down-regolazione. Risultati simili sono stati ottenuti in IHC in cui il 100% degli ACC (15/15) e il 55% degli ACA (18/33) presentano una down-regolazione di N-caderina. Conclusioni. I nostri dati sottolineano l’importanza del sistema angiogenico nei tumori corticosurrenalici. I nuovi inibitori tirosin-chinasici e di mTOR attualmente usati in alcuni tumori come strategie anti-VEGF potrebbero rappresentare un nuovo strumento terapeutico per i tumori della ghiandola surrenale. L’identificazione quindi di nuovi target molecolari anti-angiogenetici e di target nella via del segnale di Wnt/β-catenina ha contribuito ad una migliore comprensione ed a un approfondimento della tumorigenesi corticosurrenalica generando le basi per lo sviluppo di nuovi farmaci mirati (target therapy).