G-quadruplexes in the HIV-1 LTR promoter: targeting and binding proteins

I G-quadruplex sono strutture secondarie non canoniche che gli acidi nucleici possono formare in regioni ricche di guanine e regolano importanti processi biologici. Il nostro gruppo di ricerca ha identificato tre G-quadruplex mutualmente esclusivi e rilevanti dal punto di vista funzionale, localizzati nella regione LTR del promotore del virus dell’immunodeficienza umana di tipo 1 (HIV-1): la loro formazione inibisce la trascrizione virale, effetto che è incrementato dalla proteina cellulare nucleolina e da ligandi specifici. Poiché la maggior parte di composti leganti G-quadruplex conosciuti non sono in grado di riconoscere in modo sufficientemente selettivo G-quadruplex diversi, noi abbiamo indagato la possibilità di riconoscere in modo selettivo i G-quadruplex nella regione LTR di HIV-1, concetto alla base dello sviluppo di nuovi composti anti-HIV-1 caratterizzati da un innovativo meccanismo d’azione. Attraverso lo screening di una libreria commerciale di piccole molecole farmaco-simili, abbiamo identificato una nuova classe di composti con una netta selettività per i G-quadruplex virali rispetto a quelli cellulari e una promettente attività antivirale G-quadruplex mediata. Inoltre, abbiamo proposto un approccio completamente innovativo per il riconoscimento selettivo dei G-quadruplex, il quale è stato testato con successo sui G-quadruplex della regione LTR di HIV-1. A tale scopo, abbiamo utilizzato un coniugato formato da una naphthalene diimide (NDI) e da un PNA, con l’obiettivo di combinare la stabilizzazione di un composto legante G-quadruplex con il riconoscimento specifico della sequenza nucleotidica prossimale al G-quadruplex di interesse. L’utilizzo del coniugato ha permesso di stabilizzare in modo specifico il G-quadruplex LTR-IV attraverso la porzione NDI, allo stesso tempo prevenendo la formazione del G-quadruplex più stabile (dLTR-III), grazie alla presenza di un PNA disegnato per legare la regione fiancheggiante LTR-IV in posizione 5’. Il coniugato è stato inoltre implementato con una sequenza di localizzazione nucleare (NLS) per permettere l’entrata nelle cellule, senza interferire con la sua attività specifica. Questa strategia innovativa è fondamentale per riuscire a discriminare in modo specifico LTR-III e LTR-IV, il cui equilibrio sembra essere un elemento regolatore del promotore virale. Potrà inoltre essere utilizzato per modulare la formazione e la destabilizzazione di specifici singoli G-quadruplex all’interno della sequenza di lunghezza completa ricca in guanine della regione LTR, con lo scopo di investigare meglio il loro singolo ruolo e funzione. Complessivamente, questi risultati evidenziano la possibilità di riconoscere in modo selettivo i G-quadruplex attraverso l’utilizzo sia di piccole molecole sia di coniugati NDI-PNA e aprono la strada per lo sviluppo di nuovi composti antivirali che possono affiancare l’attuale terapia clinica per l’AIDS. Infine, abbiamo ricercato nuove proteine che riconoscano in modo specifico i G-quadruplex nella regione LTR di HIV-1 e modulino la loro stabilizzazione/destabilizzazione. Abbiamo identificato e caratterizzato, hnRNP A2/B1, la prima proteina cellulare in grado di destabilizzare i G-quadruplex nella regione LTR di HIV-1. Abbiamo quindi mostrato nuove evidenze nel meccanismo regolatorio della trascrizione di HIV-1, proponendo inoltre un nuovo possibile bersaglio per lo sviluppo di inibitori specifici.