Radiofarmaci "metal based" nella cardiologia nucleare e nell'imaging tumorale

Sommario Molti dei nuclidi usati nella preparazione di radiofarmaci sono metalli di transizione. Tra questi, il 99mTc, radionuclide gamma emittente (t½=6.02 h; E=141 keV), prodotto attraverso l’uso di un generatore portatile di 99Mo/99mTc, è considerato il nuclide di elezione nella diagnosi SPECT (Single Photon Emission Computed Tomography). La recente scoperta di un nuovo ed efficiente metodo per la produzione di complessi del 99mTc contenenti il legame multiplo terminale tecnezio-azoto [99mTc≣N]2+ ha aperto la possibilità di valutare l’attività biologica di diverse classi di azoturo complessi di 99mTc e di proporli come radiofarmaci di perfusione o recettore specifici. Il crescente interesse verso questa categoria di composti è proprio legato alla presenza del core [99mTc≣N]2+, che conferisce ai complessi elevata stabilità termodinamica e cinetica e resistenza ai processi ossido-riduttivi. Di conseguenza, diversi 99mTc(N)-eterocomplessi sono stati sviluppati e valutati come potenziali agenti diagnostici. Esempi ne sono complessi simmetrici bi-sostituiti del tipo [99mTc(N)(DTC)2] (DTC = ditiocarbammato), ed in particolare complessi asimmetrici bi-sostituiti del tipo [99mTc(N)(PNP)(YZ)]+/0 (PNP = amminodifosfina; YZ = ditiocarbammati, derivati della cisteina come N-Acetil-Cys [O-,S-], Cys-OEt [NH2,S-]). Tra questi, [99mTc(N)(PNP5)(DBODC)]+ (DBODC = bis-(N-etossietil)ditiocarbammato; PNP5 = bis-(dimetossipropilfosfinoetil)etossietilammina) è il composto capostitpite di una serie di derivati allo studio come potenziali agenti per l’imaging cardiaco e le cui caratteristiche biodistributive sono tali da consentire l’ottenimento di immagini di qualità diagnostica superiore a quelle ottenute con i traccianti attualmente in uso clinico (99mTc-Sestamibi e 99mTc-Tetrofosfin). Studi di distrubuzione sub-cellulare condotti sul miocardio isolato di ratto hanno evidenziato che [99mTc(N)(PNP5)(DBODC)]+ analogamente a 99mTc-Sestamibi e 99mTc-Tetrofosfin è intrappolato nelle strutture mitocondriali grazie alla presenza di un potenziali di membrana negativo. Inoltre, studi di metabolismo condotti al fine di chiarire in meccanismo di rapida rimozione di tale complesso dagli organi non bersaglio hanno dimostrato che l’agente è eliminato nella sua forma nativa e che l’escrezione è mediata da trasportatori PgP/MDR-PgP, aspetti questi che lasciano intravedere la possibilità di ampliare l’ambito di applicazione di questo tracciante e dei suoi derivati. L’introduzione in campo clinico di radiofarmaci 99mTc-target specifici contenenti piccoli peptidi, è estremamente limitato. Il punto focale nello sviluppo di questo tipo di traccianti, risiede nella necessità di disporre di un efficiente metodo di sintesi che non alteri la biospecificità della molecola nativa e che permetta di ottenere il radiofarmaco con una elevata attività specifica. In particolare, è stato dimostrato come la cisteina sia un efficiente sistema chelante per il frammento [99mTc(N)(PNPn)]2+, portando alla formazione di complessi con alta attività specifica (70 GBq∙mol-1). La cisteina è quindi un buon chelante bifunzionale per la marcatura di molecole bioattive. In questo ambito, i peptidi sintetici grazie alle loro favorevoli caratteristiche farmacocinetiche rappresentato biomolecole di prima scelta per monitorare la variazione della popolazione e della funzionalità recettoriale associata ad una patologia tumorale, rispetto all’uso di proteine a anticorpi monoclonali. Di conseguenza è sufficiente aggiungere un residuo cisteinico terminale alla sequenza amminoacidica prescelta per ottenere un legante bifunzionale in grado di reagire selettivamente con il frammento [99mTc(N)(PNPn)]2+ dando così origine al complesso finale [99mTc(N)(PNPn)(Cys-R)]+/0. Negli ultimi anni, alcuni dei membri del gruppo di ricerca hanno riportato una nuova ed efficiente metodologia sintetica per la sintesi in alta resa di azoturo complessi di Tc(V) utilizzabili nella preparazione di radiofarmaci di perfusione e recettore specifici. Tale metodo si basa sulle proprietà chimiche del complesso [99mTc(N)X2(PNP)]+/0 (PNP = difosfinammina, X = OH2, Cl-, OH-). Nel frammento molecolare [99mTc(N)(PNPn)]2+ la presenza degli atomi di fosforo π-accettori determina l’aumento delle sue caratteristiche elettrofile rendendolo particolarmente reattivo verso specie nucleofile contenenti atomi π-donatori. In particolare, leganti bidentati (YZ) che contengono atomi coordinanti quali S, O, N hanno mostrato la più alta affinità per la specie [99mTc(N)(PNPn)]2+, dando così origine ad una serie di composti asimmetrici del tipo [99mTc(N)(PNP)(YZ)]+/0 caratterizzati dalla presenza di due diversi leganti bidentati coordinati allo stesso centro metallico. La possibilità di saturare in maniera non simmetrica la sfera di coordinazione del metallo apre la strada alla realizzazione di un’ampia varietà di radiocomplessi, le cui caratteristiche chimico-fisiche possono essere finemente modulate conferendo agli stessi particolari e desiderate proprietà farmacocinetiche. Lo scopo del presente lavoro è quello di verificare la possibilità di applicare questo paradigma di sintesi alla preparazione di composti di perfusione e alla marcatura di molecole biologicamente attive di comprovata o potenziale importanza clinica sia dal punto di vista diagnostico sia terapeutico e conseguentemente alla preparazione di 99mTc-radiofarmaci capaci di interagire in modo selettivo con recettori posti sulla superficie di cellule coinvolte in processi infiammatori, degenerativi o neoplastici. Applicabilità alla preparazione di radiofarmaci di perfusione Sintesi e valutazione biologica di una serie di 99mTc(N)-eterocomplessi e loro confronto con [99mTc(N)(PNP5)(DBODC)]+ Un ideale agente di perfusione cardiaca deve presentare alcuni importanti requisiti, quali: un’elevata e persistente captazione cardiaca (proporzionale al flusso nel più ampio intervallo di valori), una rapida clearance ematica, una rapida eliminazione dai tessuti non bersaglio critici (fegato e polmoni), un’elevata estrazione di primo passaggio. A dispetto dei molteplici sforzi condotti, un tracciante cardiaco in possesso dei requisiti sopra elencati deve ancora essere trovato. Nonostante l’elevato uso clinico, 99mTc-Sestamibi e 99mTc-Tetrofosfin si discostano da questi requisiti; in particolare il loro elevato accumulo epatico rende particolarmente difficile l’interpretazione delle immagini corrispondenti alla parete infero-apicale del miocardio. Di recente, utilizzando la chimica del frammento molecolare [99mTc(N)(PNPn)]2+, è stata proposta la realizzazione di nuovi traccianti di perfusione cardiaca. In particolare, il complesso monocationico [99mTc(N)(PNP5)(DBODC)]+ ha rivelato delle proprietà biologiche che si avvicinano a quelle ideali. Studi biodistributivi hanno evidenziato un elevato e persistente accumulo del tracciante nel tessuto cardiaco, con cinetiche d’eliminazione ematica, polmonare ed epatica estremamente rapide e quantitative; fattori questi che permettono l’acquisizione in tempi brevi d’immagini di elevata qualità diagnostica, superiore a quelle ottenute con i complessi monocationici 99mTc-Sestamibi e 99mTc-Tetrofosfin. In particolare tale favorevole combinazione permette una chiara visualizzazione di alterazioni che interessano la parete infero-apicale del miocardio. A queste promettenti caratteristiche si associano aspetti indesiderabili, tipici dei traccianti monocationici, quali una relativamente bassa estrazione di primo passaggio (ca. 60%) e una trascurabile ridistribuzione se comparati con quella di complessi neutri, non in uso clinico, come 99mTc-Teboroxime (88-91%) e 99mTn(N)-Noet (80-90%). Per questi ultimi composti, l’elevata estrazione di primo passaggio e la relativa ridistribuzione sono correlate ad una maggiore mobilità dovuta alla elevata lipofilicità del prodotto e all’assenza di carica. Traccianti cardiaci caratterizzati da un’elevata estrazione di primo passaggio permettono, a tempi brevi dalla somministrazione, una corretta valutazione quantitativa dello stato dei singoli miociti e dell’efficienza della pompa cardiaca nel suo complesso anche nelle aree ipoperfuse. In questa sezione del lavoro (SEZIONE A) si intende valutare la possibilità di migliorare le caratteristiche biologiche di [99mTc(N)(PNP5)(DBODC)]+, in particolare di incrementare l’estrazione di primo passaggio mantenendo inalterate le sue favorevoli proprietà diagnostiche. Tale risultato potrà essere raggiunto variando alcuni parametri chimico-fisici, fondamentali quali il volume molecolare e la lipofilia. L’asimmetria del complesso consente infatti, attraverso l’introduzione di opportune variazioni indipendenti del legante difosfinamminico e di quello ditiocarbammico, di ottimizzare il profilo farmacocinetico del complesso finale, permettendo così di realizzare versioni sperabilmente migliorate di [99mTc(N)(PNP5)(DBODC)]+. Allo scopo sono utilizzati leganti ditiocarbammici aliciclici contenenti diversi eteroatomi opportunamente funzionalizzati. I nuovi leganti sono caratterizzati medianti analisi elementare, tecniche spettroscopiche e di spettrometria di massa. La preparazione dei nuovi complessi con 99mTc e la relativa caratterizzazione è eseguita tramite analisi cromatografiche quantitative TLC e HPLC. La stabilità in vitro è condotta valutando la resistenza alla transchelazione in presenza di eccessi di glutatione e cisteina. I traccianti di maggiore interesse sono valutati nel loro profilo biodistributivo e nella loro capacità diagnostica. [99mTc(N)(PNP5)(DBODC)]+: dalla cardialogia nucleare all’imaging tumorale 99mTc-Stestamibi è stato uno dei primi traccianti, originariamente sviluppati come radiofarmaci per imaging cardiaco, ad essere utilizzato nella diagnosi di alcuni tipi di tumore e validato come substrato MDR-PgP (multidrug resistance proteins), e quindi come tracciante nella visualizzazione in vivo attraverso l’uso di tecniche tomografiche dell’espressione di MDR-PgP. Tale utilizzo è possibile grazie al meccanismo di accumulo del tracciante all’interno delle strutture mitocondriali, guidato da un processo di diffusione passiva e sostenuto da un gradiente elettrico generato da un elevato potenziale di transmembrana mitocondriale, che ne determina un intrappolamento irreversibile. Il suo accumulo è particolarmente pronunciato, fino a dieci volte maggiore, in cellule tumorali sensibili che presentano una densità mitocondriale superiore rispetto a quella di cellule normali, in virtù di una maggiore differenza di gradiente elettrico (60 mV). Una riduzione dell’accumulo intracellulare di questo tracciante può essere correlata a diversi fenomeni biologici, alcuni dei quali sono associati alla sovra-espressione di particolari glicoproteine trans-membrana MDR-PgP, ATP dipendenti, prodotte dal gene MDR-1. Queste proteine regolano l’efflusso di numerosi agenti ad azione citotossica (con caratteristiche strutturali e funzionali diverse), rendendo in questo modo le cellule tumorali resistenti all’azione di diversi farmaci. In queste cellule l’accumulo di 99mTc-Sestamibi è inversamente proporzionale ai livelli di espressione di PgP, come dimostrato dall’aumentata captazione del tracciante dopo esposizione delle stesse a modulatori di MDR (verapamil, ciclosporina A, elacridar e valspodar). Queste sostanze, bloccando la funzione delle PgP, inducono un aumento della concentrazione del tracciante all’interno delle cellule. Dal punto di vista clinico, la valutazione in vivo dell’espressione e della funzionalità delle MDR-PgP, permette di selezionare pazienti che possono beneficiare di trattamenti terapeutici (chemioterapici); di distinguere se la farmaco resistenza che si è instaurata è mediata da PgP o meno e quindi selezionare pazienti che possono beneficiare del trattamento con inibitori delle PgP. Inoltre, misure funzionali che definiscono lo stato di MDR-PgP mediante l’applicazione di tecniche non invasive quali possono essere la SPECT rappresentano un maggior vantaggio rispetto alle tecniche di valutazione convenzionali in vitro che necessitano di prelievi bioptici. Analogamente a quanto osservato per 99mTc-Sestamibi, [99mTc(N)(PNP5)(DBODC)]+ si localizza irreversibilmente nelle strutture mitocondriali in forza di un gradiente elettrico trans-membrana negativo come dimostrato da studi di distribuzione subcellulare, condotti su miocardio isolato di ratto. Inoltre, studi di metabolismo condotti al fine di chiarire il meccanismo di rapida rimozione di tale complesso dagli organi non bersaglio hanno dimostrato che [99mTc(N)(PNP5)(DBODC)]+ è eliminato nella sua forma nativa e che l’escrezione è mediata da trasportari PgP/MDR-PgP, aspetti questi che lasciano intravedere la possibilità di estendere l’applicabilità diagnostica di questo nuovo tracciante al monitoraggio e visualizzazione di alcune forme neolastiche (benigne e maligne), caratterizzate da una elevata densità mitocondriale, nonché alla valutazione della refrattarietà delle cellule al suo accumulo. In questa sezione (SEZIONE B), è valutata in vitro la cinetica di accumulo di [99mTc(N)(PNP5)(DBODC)]+ a 4 ° e 37 °C, in alcune linee cellulari quali 2008 (human ovarian cancer) e MCF-7 (human breast cancer) e nelle corrispondenti linee farmaco-resistenti (C13 e MCF-7/MDR+), in presenza e non di opportuni MDR modulatori, utilizzando 99mTc-Sestamibi come riferimento. Applicabilità alla preparazione di radiofarmaci target-specifici Lo scopo (SEZIONE C) di questa parte del lavoro consiste nel verificare la possibilità di applicare il frammento molecolare [99mTc(N)(PNPn)]2+ alla marcatura di molecole biologicamente attive mantenendo inalterate le proprietà biologiche di queste ultime. Come già riportato, [99mTc(N)(PNPn)]2+ può essere coordinato in modo efficiente e versatile dall’amminoacido cisteina a formare complessi neutri o cariche del tipo [99mTc(N)(PNPn)(Cys-R)]+/0, caratterizzati da una elevata attività specifica. Nel caso di peptidi, l’aggiunta di un residuo cisteinico terminale alla sequenza amminoacidica prescelta consente di ottenere un chelante bifunzionale in grado di reagire selettivamente con il frammento molecolare dando così origine al complesso finale. Poiché l’aggiunta ulteriore di un amminoacido ad una catena peptidica costituisce una modificazione natuale la struttura chimica del peptide risultante non è significativamente perturbata e, in questo modo, è possibile mantenere quasi inalterate le proprietà biologiche originarie. Questa parte del lavoro è stata organizzata come segue: sintesi e modificazione di selezionate sonde molecolari con cisteina. Molecole di interesse sono derivati dell’ormone α-MSH, in grado di legare con elevata specificità e selettività recettori della melanocortina-1 (MC-1), sovraespressi sulla superficie di cellule melanomatose. I peptidi così ottenuti sono stati coniugati al frammento molecolare [99mTc(N)(PNPn)]2+ ottenendo complessi asimmetrici monocationici [99mTc(N)(PNPn)(Cys-NS)]+, o neutri [99mTc(N)(PNPn)(Cys-OS)]. preparazione dei corrispondenti complessi con 99mTc e 188Re. studi di stabilità in vitro e di transchelazione con cisteina e glutatione dei complessi radiomarcati. Valutazione biologica in vitro ed in vivo.