STUDIES ON LINEAGE SHIFT RESPONSES OF HUMAN PERIPHERAL BLOOD MULTIPOTENT CELLS

Il trapianto di cellule staminali è una strategia terapeutica che sta conoscendo uno sviluppo sempre maggiore come possibile approccio clinico per il trattamento delle malattie degenerative. Considerando i problemi di carattere etico sollevati dall’impiego delle cellule staminali embrionali, le cellule staminali adulte isolate da varie fonti (sangue cordonale, midollo osseo, tessuto adiposo﴿ rappresentano una realistica alternativa, in virtù della loro potenzialità rigenerativa ben documentata. Nel nostro laboratorio è stato standardizzato un metodo per isolare cellule staminali fibroblastoidi multipotenti (Peripheral Blood Multipotent Cells, PBMC) da sangue periferico umano, che possono essere espanse in vitro durante la coltura a lungo termine e sono in grado di differenziare in senso adipogenico, condrogenico e osteogenico. Nel lavoro di tesi del Dott. Senthilkumar Rajendran, le cellule PBMC sono state stimolate per l’ottenimento in vitro di cellule simil-neuronali e -muscolari. Inoltre è stato valutato il loro potenziale rigenerativo nel trattamento di malattie degenerative del muscolo scheletrico e del tessuto nervoso attraverso la sperimentazione in vivo su modelli animali. Al fine di testare il potenziale di differenziazione neuronale, le cellule sono state seminate (1x104) su coating di gelatina e coltivate per i primi 7 giorni in Neurobasal medium addizionato con EGF e FGF, e per i 7 giorni successivi in terreno basale contenente acido retinoico e NGF. L’induzione miogenica è stata effettuata utilizzando IGF e acido ascorbico per 14 giorni. Ad ogni time point, sono stati realizzati studi morfologici mediante SEM e analisi di espressione di specifici marcatori neuronali e miogenici mediante RT-PCR, citofluorimetria e western blot. Le cellule PBMC hanno mostrato una caratteristica morfologia simil-dendritica e l’espressione di specifici marcatori neuronali a livello sia di mRNA che di proteine. Lo studio del flusso del calcio dopo stimolazione con KCl 56 mM e l’attività di secrezione del neurotrasmettitore noradrenalina, precursore nella sintesi della dopamina, hanno confermato la capacità delle cellule PBMC di acquisire un fenotipo funzionale. Dopo marcatura con il tracker cellulare Qdot 800 e iniezione per stereotassi in un cervello di ratto, le PBMC hanno dimostrato un elevato potenziale migratorio e proliferativo dopo 10 e 20 giorni dall'impianto. Non è stata identificata alcuna massa tumorale. Il potenziale miogenico delle popolazioni isolate è stato confermato dalla loro capacità di formare strutture simil-sinciziali durante la coltura in vitro e di esprimere marcatori tipici della linea miogenica, sia a tempi precoci che nelle fasi tardive del differenziamento. Infine, testate in un modello animale di danno muscolare indotto con bupivacaina, le cellule PBMC sono state in grado di integrarsi all'interno del tessuto ospite e di prendere parte nella riparazione dei tessuti.