Ingegneria Tissutale delle Valvole Cardiache: valutazione di metodi di decellularizzazione e semine cellulari su Pericardio Bovino e Porcino

PRESUPPOSTI DELLO STUDIO: Nel mondo occidentale la patologia valvolare cardiaca presenta una prevalenza del 2% nella popolazione generale, ed è in costante crescita dato l’invecchiamento della popolazione. La terapia chirurgica attuale utilizza sostituti valvolari meccanici e biologici, che frequentemente portano i pazienti al reintervento o all'insorgenza di complicanze. L'Ingegneria Tissutale (TE), disciplina che unisce il contributo dell'ingegneria e della biologia, potrebbe permettere di creare sostituti valvolari dotati di patrimonio cellulare autologo e vitale in grado di andare incontro a rimodellamento e crescita in accordo con lo stato fisiologico dei pazienti, in particolare quelli pediatrici. SCOPO DELLO STUDIO: Gli scopi di questo studio sono stati: verificare la capacità di decellularizzazione dei metodi UTRIDOC, TRICOL e TRITDOC quando applicati al Pericardio Bovino (PB), al Pericardio Bovino di Vitello (PBV) e al Pericardio Porcino (PP); testare il potenziale di ricellularizzazione del PB UTRIDOC, TRICOL e TRITDOC e caratterizzare strutturalmente e fisicamente il PBV e il PP prima e dopo decellularizzazione TRITDOC che si è rivelato un promettente metodo per l'adesione cellulare endoteliale. Gli scaffolds ottenuti sono stati valutati come biomateriali di base per l'Ingegneria Tissutale delle valvole cardiache (TEHV). MATERIALI E METODI: Il PB è stato decellularizzato utilizzando tre metodi denominati rispettivamente: UTRIDOC, TRICOL E TRITDOC. Verificata la completa decellularizzazione del tessuto e l'organizzazione della Matrice Extracellulare (MEC) tramite tecniche istologiche ed immunoistochimiche, sulla superficie sierosa del tessuto sono stati seminati fibroblasti bovini (Pericardiociti) e cellule endoteliali umane (HUVEC). Le semine sono state eseguite in diverse condizioni sperimentali per testare la densità cellulare più promettente e i terreni di coltura più adatti. I risultati delle semine sono stati indagati attraverso colorazione dei campioni con Ematossilina ed Eosina, Test di Landegren e Test MTT. Il PB UTRIDOC è stato successivamente funzionalizzato con una sequenza peptidica sintetica proadesiva RGD (arginina, glicina, acido aspartico), ed è stata testata l'adesione dei Pericardiociti. Il protocollo TRITDOC è stato poi applicato anche al PBV e al PP. In quest'ultimi esperimenti i pericardi sono stati espiantati dopo sacrificio degli animali e suddivisi in 4 aree anatomiche: VsxANT, VdxANT, VsxPOST, VdxPOST. Per ogni area dei pericardi trattati TRITDOC e non trattati sono stati determinati lo spessore, la densità e il contenuto d’acqua medi. La qualità della decellularizzazione e la preservazione delle matrici sono state valutate tramite istologia, DAPI, immunoistochimica (IHC) e microscopia elettronica a trasmissione (TEM). L'eliminazione dell'antigene xenogenico alpha-Gal dai PBV e dai PP TRITDOC, è stata valutata tramite test ELISA. RISULTATI: Tutti i metodi di decellularizzazione sono in grado di eliminare totalmente la componente cellulare dai tessuti pericardici, inoltre mantengono inalterata l'organizzazione generale della MEC. I test di semina cellulare hanno mostrato che i Pericardiociti aderiscono alla superficie sierosa del PB UTRIDOC dopo 6h e 18h dalla semina e cominciano ad entrare nella MEC dopo 7 giorni nel PB TRICOL e UTRIDOC, mantenendo un metabolismo attivo. In presenza del peptide proadesivo sintetico RGD, i pericardiociti aderiscono meglio al PB UTRIDOC anche utilizzando concentrazioni cellulari di semina minori. Le cellule HUVEC riescono ad aderire alla superficie sierosa del PB UTRIDOC se seminate per 1h, 3h, 5h e 24h, ma non formano un monostrato continuo. Dopo un tempo di 7 giorni dalla semina invece, aderiscono più uniformemente sul PB UTRIDCOC e formano un monostrato sul PB TRITDOC, mantenendo l'espressione dei marcatori endoteliali vWf e CD31. Considerando l’intero PBV, il trattamento TRITDOC causa una riduzione dello spessore (p>0,05), un incremento della densità (p<0,05) e una parziale disidratazione del tessuto (p<0,05). Nel PP TRITDOC, nel VsxANT e nel VdxANT lo spessore è aumentato non significativamente (p>0,05) e il contenuto d’acqua si è ridotto invece in maniera significativa (p<0,05), mentre nel VdxPOST e nel VsxPOST lo spessore e il contenuto d’acqua si sono ridotti in modo non significativo (p>0,05). Dopo decellularizzazione, la densità del PP non si è modificata significativamente (p>0,05) rispetto al tessuto nativo. Inoltre, le aree che ricoprono il VsxANT nel PB e il VdxANT nel PP sono risultate le più omogenee per le proprietà fisiche sopra menzionate, sia prima sia dopo decellularizzazione. Le analisi morfo-strutturali eseguite, l’istologia e la valutazione al TEM hanno rilevato una struttura della matrice e un’organizzazione delle fibre collagene sostanzialmente preservata dal trattamento TRITDOC. CONCLUSIONI: I protocolli di decellularizzazione UTRIDOC, TRICOL e TRITDOC producono scaffolds pericardici bovini e porcini acellulari, non citotossici e con una MEC strutturalmente preservata. Il PB TRITDOC sembra lo scaffold più adatto per la semina di cellule umane endoteliali HUVEC. La decellularizzazione del PBV e del PP con il protocollo TRITDOC, ha inoltre permesso di individuare delle aree pericardiche di potenziale interesse per la TEHV. Studi approfonditi sulle prestazioni meccaniche e sul ripopolamento cellulare di queste matrici permetteranno una valutazione più accurata dell’effetto del trattamento