Relationship between AOPP (Advanced Oxidation Protein Products) and bovine neutrophils "in vitro": AOPP production by neutrophils and AOPP effects on neutrophils ROS production and viability

Lo scopo del presente studio è stato quello di valutare le relazioni tra AOPP (prodotti avanzati di ossidazione proteica) e i neutrofili di bovino "in vitro". A questo scopo le AOPP sono state generate "in vitro", ossidando l'albumina sierica bovina con HOCl (acido ipocloroso) mentre i neutrofili di bovino sono stati isolati da sangue intero di bovine da latte. Le AOPP-BSA sono state incubate con i neutrofili di bovino appena isolati in condizioni di assenza di stimolo o stimolati con PMA un forte attivatore del "burst" respiratorio. La produzione di ROS da parte dei neutrofili e la loro vitalità , sono state misurate rispettivamente mediante chemiluminescenza amplificata dal luminolo e dai saggi MTT e lattato deidrogenasi (LDH). I risultati ottenuti hanno mostrato che le AOPP-BSA sono in grado di ridurre significativamente la produzione di ROS da parte dei neutrofili stimolati con PMA e la loro vitalità , misurata con il saggio MTT mentre non è stata rilevata lisi cellulare mediante saggio LDH. Sulla base di questi risultati il presente lavoro si è proposto di studiare se le AOPP sono in grado di scatenare eventi apopotici. A questo scopo le caspasi 3, 8 , 9 e la frammentazione del DNA sono stati utilizzati come marker con l'obiettivo di discriminare tra la via intrinseca e quella estrinseca di apoptosi. I risultati ottenuti hanno mostrato che i neutrofili di bovino non stimolati e incubati con AOPP-BSA per 1 ora e 6 ore, presentano una maggiore ma non significativa produzione di caspasi 8 attiva, se comparati con l'incubazione con BSA. Anche la caspasi 3 mosta un incremento, non significativo in neutrofili non stimolati incubati con AOPP-BSA per 6 ore, rispetto all'incubazione con BSA. Non è stata ottenuta alcuna differenza per quanto riguarda la caspasi 9 e la frammentazione del DNA. Tuttavia, in queste condizioni sperimentali è possibile concludere che la via intrinseca dell'apoptosi non è coinvolta nella riduszione della funzionalità  dei neutrofili di bovino o nella loro vitalità  ma i neutrofili di bovino incubati con AOPP-BSA sembrano piuttosto essere 'accompagnati' verso le fasi precoci della via estrinseca dell'apoptosi. Inoltre, il seguente studio ha voluto valutare la capacità  dei neutrofili di bovino attivati di generare AOPP 'in vitro'. La BSA è stata incubata con neutrofili di bovino non stimolati e stimolati con PMA per 1-2-3 ore, ed è stata misurata la formazione di specifici marcatori di ossidazione proteica come le AOPP le ditirosine e i carbonili. La BSA incubata con neutrofili stimolati con PMA, presenta un livello significativamente alto di AOPP e ditirosine rispetto all'incubazione con neutrofili non stimolati. I carbonili invece sembrano non essere prodotti in queste condizioni, almeno nelle fasi inziali dell'incubazione. In parallelo, la BSA incubata con la stessa concentrazione di HOCl prodotta dai neutrofili stimolati, per 1-2-3 ore, presenta livelli più elevato di AOPP, ditirosine e carbonili. Tuttavia è possibile concludere che i neutrofili di bovino sono in grado di ossidare la BSA e generare modificazioni chimiche e strutturali come AOPP e ditirosine nelle condizioni sperimentate. I carbonili invece sembrano non essere un marcatore specifico di ossidazione proteica mediata dai neutrofili. In aggiunta la diretta esposizione della BSA all'HOCl non è in grado di mimare completamente la complessità  degli eventi che portano all'ossidazione della BSA e alla produzione di AOPP da parte dei neutrofili attivati.