Molecular and physiological mechanisms of stress signalling in plants.

Lo scopo di questa tesi di dottorato è stato lo studio dei meccanismi molecolari e fisiologici coinvolti nella trasduzione dei segnali di stress nelle piante. Quando le piante sono esposte a condizioni ambientali di crescita non ideali, si trovano in condizioni di stress. In queste condizioni, la crescita delle piante e la resa delle colture d’interesse agronomico sono di solito fortemente ridotte. In generale, le condizioni di crescita sfavorevoli sono causate da agenti patogeni (stress biotici) e da condizioni ambientali non ideali (stress abiotici) come caldo, freddo, siccità, carenza di nutrienti e metalli pesanti. Le piante esposte a stress biotici e abiotici attivano vie di segnalazione che inducono il cambiamento dell'espressione genica, quindi, l'alterazione del trascrittoma, proteoma e metaboloma. Tutti questi processi sono orientati all’acclimatazione delle piante alle condizioni di crescita avverse. Durante il mio dottorato di ricerca ho affrontato lo studio di due meccanismi di segnalazione dello stress, uno che si verifica in seguito ad esposizione ad elevate concentrazioni di citochinine (CKs), una condizione fisiopatologica (stress biotici), e l'altro in risposta a stress ossidativo indotto da alte concentrazioni di cadmio (stress abiotici). Per quanto riguarda il primo meccanismo di segnalazione, ho studiato il ruolo dei recettori citochininici nella via di segnalazione e induzione della morte cellulare programmata (PCD) in colture cellulari di Arabidopsis thaliana trattate con alte concentrazioni di CKs. Per far ciò, abbiamo generato colture cellulari da una linea wild-type e da tre linee mutanti (knock-out) di Arabidopsis, in geni che codificano per diversi recettori citochininici (cre1-2, ahk2-5 ahk3-7 e ahk2-5 ahk3-7-cre1-2). In seguito, abbiamo caratterizzato alcuni parametri fisiologici di queste colture cellulari, in particolare, abbiamo determinato la crescita e la cinetica di morte e il contenuto di CKs. Non sono state riscontrate differenze evidenti nelle cinetiche di crescita e morte tra cellule wild-type, e linee cellulari mutanti, ad eccezione di un ritardo nella morte cellulare nelle ultime fasi del ciclo di coltura del triplo mutante. Inoltre, sono stati misurati livelli più elevati di CKs nelle linee cellulari mutanti. Infine, per verificare se i recettori citochininici fossero coinvolti nell’induzione della PCD in seguito al trattamento con alte concentrazioni di CK, è stata analizzata la risposta delle colture cellulari wild-type e mutanti ad alte concentrazioni di CKs. I risultati di questi esperimenti hanno rivelato che il recettore CRE1/AHK4 sia quello coinvolto nel meccanismo di segnalazione e induzione della PCD in colture cellulari di Arabidopsis esposte ad alte concentrazioni di CK. Per quanto riguarda il secondo meccanismo di segnalazione, ho studiato il ruolo delle GAPDH citosoliche (GAPC-1 e GAPC-2) di Arabidopsis nelle vie di segnalazione indotte da stress ossidativo in presenza di alte concentrazioni di cadmio. A tal fine, sono state trattate piantine di Arabidopsis con alte concentrazioni di cadmio e i risultati hanno mostrato che tale trattamento induceva un aumento dei livelli di ossido nitrico (NO) e perossido d’idrogeno (H2O2), e tale aumento causava l’induzione di una condizione di stress ossidativo. In queste condizioni di stress si è osservato un aumento dell’espressione di entrambi i geni GAPC. Essendo GAPC-1 il gene che mostrava l’aumento di espressione maggiore, ho prodotto delle linee transgeniche di Arabidopsis che esprimevano stabilmente geni reporter trascrizionali e traduzionali per GAPC-1. L'esposizione di queste linee transgeniche al cadmio ha rivelato che GAPC-1 è influenzata dallo stress ossidativo sia a livello trascrizionale che post-trascrizionale. Inoltre, dalle analisi in vitro si è osservato che NO e H2O2 influenzavano negativamente l'attività catalitica GAPDH in modo tempo- e concentrazione-dipendente. Questi risultati hanno confermato che le condizioni di stress ossidativo indotte da un aumento delle concentrazioni di NO e di H2O2 possono influenzare l'attività catalitica di GAPC-1, attivando una via di segnalazione che porta a un aumento della sua espressione e quindi il suo accumulo. Riducendo lo stato redox con il glutatione ridotto, l'attività catalitica della GAPC-1 ricombinante inattivata dal trattamento con NO si ripristinava. Inoltre, la presenza di glutatione ridotto riduceva sia l’attività promotoriale di GAPC-1 che i livelli di GAPC-1 in vivo. Peraltro, riducendo il contenuto di glutatione in vivo (quindi imponendo una condizione più ossidante) si è osservato l'aumento dell’attività promotoriale di GAPC-1 ed un aumento dei livelli di GAPC-1. Infine, prolungate condizioni di stress ossidativo hanno portato all’accumulo di GAPC-1 all’interno del nucleo. Questi risultati dimostrano che GAPC-1 è un sensore di stress ossidativo, e la sua rilocalizzazione nucleare potrebbe essere un passaggio chiave per la segnalazione dello stress ossidativo. Lo studio di come le piante percepiscano le condizioni di stress, i meccanismi con cui le piante trasmettono segnali di stress, ed infine lo studio dei meccanismi di acclimatazione a condizioni di crescita sfavorevoli potrebbe aiutare ad intervenire per ridurre gli effetti negativi di stress biotici e abiotici sulla crescita delle piante e sulla resa delle colture di interesse agronomico.