Yeast models for the study of mitochondrial genetic defects and other metabolic disorders

S. cerevisiae è un sistema molto versatile per studiare la funzione dei geni coinvolti in numerose vie mitocondriali e metaboliche. La maggior parte dei geni umani coinvolti in tali processi presentano ortologhi in lievito. Inoltre, questo organismo è facile da manipolare ed è in grado di produrre ATP sia attraverso la glicolisi che attraverso la catena respiratoria, sulla base della fonte di carbonio fornita; tale caratteristica permette lo studio fenotipi mitocondriali. Per tutte queste ragioni, abbiamo impiegato S. cerevisiae per la caratterizzazione funzionale di geni coinvolti in alcune malattie ereditarie metaboliche e mitocondriali. L’atrofia girata della retina e della coroide (GA) è una malattia autosomica recessiva causata da mutazioni a livello dell’enzima ornitina aminotransferasi (OAT), una proteina della matrice mitocondriale coinvolta nel metabolismo dell’ornitina. Abbiamo individuato una serie di mutazioni missenso nel gene OAT e ne abbiamo dimostrato la patogenicità in un modello di S. cerevisiae deleto per il gene CargB, l'omologo di OAT. Ulteriori studi sull’analisi della stabilità della proteina e la misurazione dell’attività enzimatica residua hanno permesso di chiarire il meccanismo attraverso il quale le differenti mutazioni missenso influiscono sulla funzione dell’enzima. Tuttavia questi dati non permettono di stabilire alcuna correlazione genotipo-fenotipo, suggerendo che altri fattori oltre la specifica variazione aminoacidica sono responsabili per la variabilità fenotipica osservata nei pazienti. Cox23p è una proteina di lievito localizzata nei mitocondri e coinvolta nell’ assemblaggio della COX, il complesso IV della catena respiratoria. Possiede il dominio twin CX9C, presente in altre proteine coinvolte nel trasporto del rame. Nel nostro laboratorio abbiamo identificato mediante un approccio bioinformatico il suo omologo umano, hCOX23 e ne abbiamo caratterizzato la funzione. Abbiamo dimostrato con tecniche di spettrometria di massa che la proteina ricombinante lega Cu (I), fornendo la prima prova diretta della sua abilità di legare il rame. Il silenziamento di COX23 in cellule HeLa non ha evidenziato alcun fenotipo. Al contrario, l’espressione del gene umano in un ceppo di lievito deleto per il gene corrispondente, ha dimostrato che COX23 può complementare il fenotipo, confermando il suo coinvolgimento nel processo di assemblaggio della COX. Abbiamo inoltre dimostrato che yCox23p è localizzato nello spazio intermembrana (IMS) e che Cmc4p, un'altra proteina contenente il dominio twin CX9C , ha funzioni rindondanti. Dal momento che la maggior parte dei deficit primari di COX non hanno ancora una causa nota, la caratterizzazione dei geni coinvolti nella biogenesi COX è di primaria importanza per trovare nuovi possibili candidati responsabili di queste patologia. Coq6p è una monoossigenasi coinvolta nella sintesi di CoQ6 in lievito. Recentemente mutazioni puntiformi nel suo omologo umano sono state associate con la sindrome nefrosica steroido-resistente (SRNS). Abbiamo espresso le mutazioni missenso in un ceppo di lievito deleto per il gene Coq6 e abbiamo dimostrato che tutte le mutazioni riducono o aboliscono la capacità del gene umano di complementare il fenotipo del lievito deleto. Le mutazioni umane sono state successivamente introdotte nei rispettivi residui conservati del gene di lievito. Questo ha permesso di dimostrare che tutte queste combinazioni alleliche presentano una certa attività residua. Tali dati supportano l’ipotesi che la mancanza totale di CoQ biosintesi è letale a livello embrionale. OPA1 è una proteina mitocondriale coinvolta in diversi processi cellulari tra cui la fusione mitocondriale ed l’apoptosi. Mutazioni a livello di questa proteina causano l’atrofia ottica dominante (ADOA), la più comune neuropatia ottica ereditaria. Nell’uomo il gene OPA1 è presente in 8 differenti varianti di splicing, ognuna delle quali può originare una forma lunga, attaccata alla membrana mitocondriale interna (IMM) e una forma solubile, localizzata nel IMS. Il processamento di OPA1 è strettamente regolato, in quanto il rapporto tra le due forme è importante per le funzioni della stessa. Numerose proteasi sono state indicate come coinvolte in tale processo. Per caratterizzare questo meccanismo e per comprendere il ruolo specifico di ciascuna delle isoforme di splicing, abbiamo deciso di impiegare un modello di S. cerevisiae deleto per Mgm1, l'omologo di OPA1. L’espressione delle singole varianti di splicing non è in grado di ripristinare la crescita del ceppo deleto mentre una forma ibrida della proteina, contenente la sequenza di import mitocondriale e di processamento di Mgm1, permette il recupero del fenotipo di ΔMgm1. Questi dati indicano che la funzione di OPA1 è conservata e la mancanza di complementazione di OPA1 è probabilmente dovuta ad un differente meccanismo di processamento nel lievito rispetto all’uomo. Il gene ibrido rappresenterà un semplice strumento per studiare la patogenicità di missenso OPA1 mutazioni identificate nei pazienti con ADOA e ADOA plus. Nel complesso questi dati dimostrano che il lievito rappresenta un sistema semplice ed efficace per caratterizzare la funzione e per studiare la patogenicità di un ampio spettro di proteine coinvolte nei processi di respirazione, morfologia mitocondriale e in altre vie metaboliche.