Role of TGF-Bs growth factors in development of aortic aneurysms. Study in a mouse model of Marfan syndrome.

Lo studio qui presentato, si propone di porre le basi per un progetto che interessa l'analisi delle anomalie vascolari, in particolare aneurisma aortico, nella sindrome di Marfan, malattia sistemica che colpisce principalmente i sistemi scheletrico, oculare e vascolare. Anche se e' ormai dimostrato che anomalie a carico del gene Fbn1, che codifica per una proteina delle fibre elastiche, la Fibrillina-1, sono la causa principale dell'insorgenza della malattia, risulta ancora poco chiara la patogenesi delle alterazioni fenotipiche, in particolare del'aneurisma aortico. Considerando la funzione della Fibrillina-1 come deposito di fattori di crescita, l'ipotesi attualmente piu' accreditata, suggerisce che ci sia una alterata regolazione del segnale di TGF-B alla base della manifestazione e progressione dell'aneurisma aortico. Concordemente a questa ipotesi, l'analisi di modelli animali, come i topi Fbn1+/C1039G, che portano una mutazione puntiforme di una aminoacido frequentemente mutato nella sindrome di Marfan, ha riscontrato un incremento di P-Smad2/3 e di espressione di geni bersaglio di TGF-B a livello dell'aneurisma. Tuttavia, i dati hanno suggerito la possibile implicazione di altre vie di segnale (Angiotensina II, MAPK), mentre non e' stato considerato il ruolo di BMP, un fattore di crescita che lega direttamente la Fibrillina-1 e di cui e' stato prospettato un ruolo nelle alterazioni scheletriche della sindrome. In questo studio abbiamo inizialmente analizzato i livelli di attivazione delle vie del TGF-B e BMP a diverse età a livello dell'arco aortico e nel tratto discendente dell'aorta in topi Fbn1+/C1039G. Nei Fbn1 mutanti, i dati mostrano un incremento del segnale di entrambe le vie a 2 e 4 mesi, ma non a 7 mesi, quando invece l'aneurisma e' presente. L'analisi ha poi evidenziato una mancata correlazione tra i livelli di espressione di PAI-1 e Ctgf, geni bersaglio per TGF-β, e P-Smad2/3 a livello dell'arco aortico a 7 mesi, suggerendo l'implicazione di altre vie di segnale. Per quanto riguarda l'espressione dei geni bersaglio di BMP, è stata osservata corrispondenza tra lâ espressione di Id2 e i livelli di P-Smad1/5/8; Id3 invece, rimane aumentato nei mutanti anche a 7 mesi, evocando, anche in questo caso, la possibilità dellâ intervento di altri fattori. Lo studio ha 9 inoltre previsto la generazione di un sistema di espressione inducibile, basato sulla tecnologia del sistema Tet-On, sensibile alla doxiciclina, per la modulazione delle vie di TGF-β/BMP nella cellule muscolari lisce di aorta (CMLV). Sono state generate linee transgeniche per il transattivatore (rtTA), controllato dal promotore del gene Smmhc, e per i geni bersaglio (caALK5, caAlk3, Smad7, Smad6, Noggin) controllati dal promotore inducibile TRE-CMVmin. Le analisi di RT-PCR in vitro in CMLV ed in vivo in aorta di topi doppi transgenici, hanno evidenziato il corretto funzionamento del sistema inducibile e la parziale correlazione tra via di segnale modulata ed espressione dei geni bersaglio. Contemporaneamente utilizzando la linea transgenica Smmhc-CreERT2 è stata indotta lâ inattivazione del gene Smad4 in topi adulti mutanti e non per Fbn1. Lâ inibizione di entrambe le vie di segnale comporta già in topi non mutanti, la comparsa di danno di parete, dilatazione a livello dellâ arco aortico e morte per dissezione aortica entro 6 mesi dallâ inattivazione del gene. Inoltre la mancanza di Smad4 nelle CMLV in topi Fbn1+/C1039G causa un peggioramento dellâ aneurisma toracico, caratterizzato da incremento della dilatazione aortica e del danno parietale. In aggiunta nei topi Fbn1+/C1039G, knockout per Smad4, si sviluppa anche un aneurisma addominale, normalmente mai osservato nei modelli Marfan. Lâ incremento del danno strutturale nei topi mutanti per Fbn1 e Smad4 porta a morte precoce per rottura dellâ aneurisma, un evento che si verifica molto raramente nei topi con la sola mutazione di Fbn1. Queste prime osservazioni, che andranno ampliate e affiancate da uno studio molecolare delle vie di segnale sopra menzionate, suggeriscono un effetto protettivo di TGF-β/BMP nella comparsa e progressione di aneurismi aortici. Questa considerazione trova conferma nei dati relativi ad incremento di dissezione ed aneurisma aortico, in seguito ad inibizione di TGF-β, in modelli animali diversi da quello qui analizzato.