16S rRNA gene sequencing sparse count matrices: a count data simulator and optimal pre-processing pipelines

Lo studio delle comunità microbiche è profondamente cambiato da quando fu per la prima volta proposto nel XVII secolo. Quando il ruolo fondamentale dei microbi nel regolare e causare malattie umane divenne evidente, i ricercatori iniziarono a sviluppare una varietà di tecniche per isolare e coltivare i batteri in laboratorio con l'obiettivo di caratterizzarli e classificarli. Alla fine degli anni '70, una svolta in come venivano studiate le comunità batteriche fu apportata dalla scoperta che i geni che codificano per l'RNA ribosomale (rRNA) potevano essere utilizzati come marcatori molecolari per la classificazione degli organismi. Alcuni decenni più tardi, l'avvento della tecnologia di sequenziamento del DNA ha rivoluzionato lo studio delle comunità microbiche, consentendo una visione complessiva coltura-indipendente della comunità contenuta in un campione. Oggi, uno degli approcci più diffusi per profilazione di comunità microbiche si basa sul sequenziamento del gene che codifica per la subunità 16S del ribosoma procariotico (gene dell'rRNA 16S). Poiché il ribosoma svolge un ruolo essenziale nella vita procariotica, esso è onnipresente in tutti i batteri, ma la sua esatta sequenza di DNA è unica per ogni specie. Per questo motivo, esso viene utilizzato come una sorta di impronta molecolare per assegnare a ciascun membro della comunità una caratterizzazione tassonomica. L'avvento delle piattaforme di Next Generation Sequencing (NGS), in grado di produrre un'enorme mole di dati riducendo tempi e costi, ha assicurato alla tecnica di sequenziamento del gene rRNA 16S (16S rDNA-Seq) una crescita nel tasso di elezione come metodologia preferita per eseguire studi sul microbioma. Nonostante ciò, il continuo sviluppo di procedure sia sperimentali che computazionali per 16S rDNA-Seq ha causato una inevitabile mancanza di standardizzazione riguardo al trattamento e all'analisi dei dati di sequenziamento. Ciò è ulteriormente complicato dalle caratteristiche molto peculiari che contraddistinguono la matrice in cui tipicamente le informazioni dei campioni sono riassunte dopo il sequenziamento. Infatti, il limite strumentale sul numero massimo di sequenze ottenibili rende i dati 16S rDNA-Seq composizionali, cioè dati in cui l'abbondanza rilevata di ogni specie batterica dipende dal livello di presenza di altre popolazioni nel campione. Inoltre, le matrici derivate da 16S rDNA-Seq sono in genere molto sparse (70-95% di valori nulli). Ciò è dovuto sia alla diversità biologica tra i campioni sia alla perdita di informazione sulle specie rare durante il sequenziamento, un effetto che è fortemente dipendente sia dalla distribuzione solitamente asimmetrica delle abbondanze delle specie presenti nei microbiomi, sia dal numero di campioni sequenziati nella stessa corsa di sequenziamento (il cosiddetto livello di multiplexing). Le suddette peculiarità rendono la comunemente adottata mutuazione di tool e approcci dall’ambito del sequenziamento di tipo bulk RNA inadeguata per analisi di matrici di conte derivanti da 16S rDNA-Seq. In particolare, fasi di pre-elaborazione non specifiche, come la normalizzazione, rischiano di introdurre forti bias in caso di matrici molto sparse. L'obiettivo principale di questa tesi era quello di identificare delle pipeline di analisi ottimali che riempissero le suddette lacune al fine di ottenere conclusioni solide e affidabili dall'analisi dei dati dell'rRNA-Seq 16S. Tra tutte le fasi di analisi incluse in una tipica pipeline, questo progetto si è concentrato sulla pre-elaborazione di matrici di conte ottenute da esperimenti di 16S rDNA-Seq. Questo scopo è stato raggiunto attraverso diversi passaggi. In primo luogo, sono stati identificati metodi all'avanguardia per la pre-elaborazione dei dati di conte di 16S rDNA-Seq eseguendo un'accurata ricerca bibliografica, che ha rivelato una minima disponibilità di strumenti specifici e la completa mancanza nella consueta pipeline di analisi 16S rDNA-Seq di una fase di pre-elaborazione in cui venga recuperata la perdita di informazioni dovuta al sequenziamento (zero-imputation). Allo stesso tempo, la ricerca bibliografica ha evidenziato che non erano disponibili simulatori specifici per ottenere direttamente dati di conte 16S rDNA-Seq sintetici su cui eseguire l'analisi per identificare pipeline di pre-elaborazione ottimali. Di consequenza, è stato sviluppato un simulatore di matrici di conte sparse derivanti da 16S rDNA-Seq che considera la natura composizionale di questi dati. In seguito, un'analisi comparativa completa di quarantanove pipeline di pre-elaborazione è stata progettata ed eseguita con lo scopo di valutare le prestazioni degli approcci di pre-elaborazione più comunemente utilizzati e più recenti e per verificare l’appropriatezza dell’inclusione di una fase di zero-imputation nel contesto delle analisi di 16S rDNA-Seq. Nel complesso, questa tesi considera il problema della pre-elaborazione dei dati provenienti da 16S rDNA-Seq e fornisce una guida utile per una pre-elaborazione dei dati robusta quando durante un'analisi 16S rDNA-Seq. Inoltre, il simulatore proposto in questo lavoro potrebbe essere uno stimolo e uno strumento prezioso per i ricercatori coinvolti nello sviluppo e nel test dei metodi di bioinformatica, contribuendo così a colmare la mancanza di strumenti specifici per i dati di rDNA-Seq 16S.