analisi del contributo delle poliproteine GAG e POL nello sviluppo della resistenza in pazienti HIV-1 positivi sottoposti a terapia antiretrovirale

L’introduzione della Highly Active Antiretroviral Therapy (HAART) a metà degli anni Novanta per la cura dell’AIDS ha fortemente ridotto la morbosità e la mortalità ad essa associate e sensibilmente esteso l’aspettativa e la qualità della vita dei pazienti HIV-1 positivi. Attualmente sono più di 20 gli inibitori approvati per l’uso clinico e sono in grado di agire negativamente in diverse fasi del ciclo replicativo virale, quali l’ingresso del virus nella cellula ospite (antagonisti dei corecettori ed inibitori di fusione), la retrotrascrizione (inibitori nucleosidici, NRTIs, e non nucleosidici, NNRTIs, della retrotrascrittasi) e l’integrazione del genoma virale (inibitori dell’integrasi) ed il processo di maturazione della particella virale (inibitori della proteasi, PIs). Le attuali Linee Guida raccomandano strategie terapeutiche che prevedono la combinazione di farmaci appartenenti ad almeno due classi distinte, generalmente due NRTIs in associazione ad un PI o un NNRTI, considerati lo standard of care per il trattamanto dell’infezione da HIV-1. Nonostante il successo dell’approccio combinatorio, il maggior fattore che contribuisce al fallimento terapeutico rimane lo sviluppo di resistenze. La perdita di sensibilità ai farmaci è dovuta principalmente all’insorgenza di mutazioni che alterano il sito di legame degli enzimi virali agli inibitori (Menéndez-Arias, 2010). Attualmente, molte di queste mutazioni, definite mutazioni di resistenza, sono ben caratterizzate (Johnson et al., 2010) e vengono utilizzate nei test genotipici di routine per identificare le cause del fallimento terapeutico, anche se in alcuni casi queste informazioni non sono sufficienti a spiegare il quadro clinico osservato. Studi recenti indicano che, oltre alle sequenze codificanti gli enzimi virali bersaglio della terapia, altre regioni del genoma virale possono contribuire allo sviluppo di resistenze. In particolare, la perdita di attività catalitica della proteasi dovuta alle mutazioni di resistenza può essere compensata da sostituzioni amminoacidiche presenti nelle vicinanze o a livello dei siti di taglio in Gag (Parry et al., 2009; Dam et al., 2009; Nijhuis et al., 2007), così come da sostituzioni a carico del segnale di scorrimento dei ribosomi tra i geni gag e pol (Doyon et al., 1998), che favoriscono il processamento dei precursori poliproteici virali. Inoltre, alcuni residui della retrotrascrittasi sembrano svolgere un ruolo critico nella corretta regolazione della maturazione dei precursori Gag e Gag-Pol (Nishitsuji et al., 2011; Chiang et al., 2012). Sebbene sia aumentata la consapevolezza della rilevanza che hanno altri domini proteici di HIV-1, oltre agli enzimi PR ed RT, nella predizione ed acquisizione delle farmacoresistenze, non sono ancora chiarite le ricadute funzionali che tali specifici mutazioni hanno nel ciclo biologico del virus. Inoltre, i dati disponibili non sono ancora unanimi nel definire l’importanza relativa di ciascuna regione analizzata, ad esempio nella proteina Gag (Dam et al., 2009; Parry et al., 2007). In tale contesto, abbiamo voluto investigare il ruolo svolto dalla proteina Gag come substrato naturale della proteasi virale ed il suo contributo nei meccanismi di resistenza. Sono state quindi ottimizzate le condizioni di amplificazione e di sequenziamento del gene gag a partire da isolati virali di diverso sottotipo. In collaborazione con il Professor Parisi, Università degli Studi di Padova, sono stati selezionati dei pazienti HIV-1 positivi che hanno fallito il trattamento terapeutico basato su PIs e RTIs all’interno della coorte Veneta CAVeAT, comprensiva di cinque Unità di Malattie Infettive. Di ciascuno di questi sono stati analizzati i profili di resistenza e le sequenze del gene gag per identificare le posizioni variabili. Allo scopo di determinare il contributo della proteina Pr55Gag nei meccanismi di resistenza e la sua specifica funzione nel ciclo biologico del virus, è stata disegnata una strategia di clonaggio che permette di analizzare il contributo differenziale della regione ammino- o carbossi-terminale di Gag in presenza o in assenza degli enzimi PR-RT mutati. Con questo sistema ciascun prodotto di amplificazione ottenuto dall’RNA estratto dal paziente può essere inserito direttamente nel genoma provirale di HIV-1. Nello specifico, è stato utilizzato un sistema di trans-complementazione dell’envelope, sviluppato in precedenza nel nostro laboratorio, che permette la pseudotipizzazione con envelope eterologhi espressi in trans di virioni competenti per un solo ciclo replicativo. Tra tutti i pazienti analizzati, è stato scelto di analizzare l’effetto di specifiche mutazioni a carico della regione N-terminale di Gag di quello che presentava un’unica mutazione di resistenza in PR. Dai risultati ottenuti è emerso che: (i) la presenza della regione N-terminale derivata dal paziente porta ad un aumento dell’attività retrotrascrittasica e del contenuto di p24 nel suranatante delle cellule utilizzate per la produzione dei virioni ricombinanti rispetto a quanto osservato nel virus wild type; (ii) nel sistema utilizzato la sequenza amminoacidica del sito di taglio MA/CA derivata dal paziente non sembra influenzare l’accessibiltà del sito per la proteasi wild type; (iii) le mutazioni a carico della regione N-terminale di Gag derivata dal paziente riducono l’infettività dei virioni ricombinanti che la esprimono. Nel complesso, i risultati ottenuti possono contribuire a caratterizzare le relazioni funzionali che intercorrono tra Gag e gli enzimi PR ed RT nei meccanismi di resistenza e nel ciclo biologico del virus