Utilizzo di minigeni ibridi per la validazione di mutazioni di splicing

L’ interpretazione di numerose varianti di sequenza di significato biologico e clinico sconosciuto (UV) trovate in screening di popolazione o pazienti rappresenta una sfida nella diagnosi molecolare delle malattie genetiche, inclusa la predisposizione al cancro. Una parte di UV potrebbe avere effetto deleterio perchè possono interessare lo splicing dell’mRNA. L’approccio diretto per determinare se la malattia è associata alle mutazioni di splicing è attuare un’analisi dell’mRNA dei tessuti dei pazienti affetti dalla patologia tramite retrotrascrizione (RT-PCR). Tuttavia, i campioni di tessuto non sono sempre disponibili perchè l’espressione di questi geni possono essere tessuto-specifica (per esempio in cervello o cuore) o i pazienti sono troppo lontani dal laboratorio di analisi. Un approccio alternativo è testare la mutazione di splicing con l’uso dei minigeni. Qui, descriviamo un metodo funzionale di studio di splicing basato sull’utilizzo di minigeni che valutano l’impatto sullo splicing di varianti di sequenza. Un segmento genomico che comprende la variante di splicing di interesse comprese le zone introniche fiancheggianti, amplificata dal paziente mediante PCR è clonata nel minigene. Dopo una trasfezione transiente in culture cellulari umane, il pattern dei trascritti generati dal wild-type e dal mutato sono confrontati mediante PCR da retrotrascrizione e successivo sequenziamento. Con l’utilizzo di minigeni classici è possibile incontrare delle difficoltà in quanto si possono trovare ostacoli nel clonaggio del frammento che contiene la mutazione nel minigene. Molte volte il frammento di DNA contiene dei siti di restrizione incompatibili con quelli del minigene, o la reazione di ligazione può essere complicata data la grandezza dell’inserto. Per superare questi problemi abbiamo clonato una cassetta Gateway per permettere un veloce e facile clonaggio. Con questo metodo abbiamo testato 16 mutazioni in differenti geni (NF1, CFTR, AIP, COQ6, STK11) con risultati conclusivi