Mathematical Modeling of Cellular Mechanisms in Endocrine Secretory Cells

Il sistema secretorio endocrino è formato da un insieme di cellule, che hanno l' obiettivo di agire da sensore e direttamente, o indirettamente, di controllare delle funzioni critiche nelle cellule target. Nello specifico, il loro ruolo è quello di rilasciare nella circolazione sanguigna diversi tipi di ormoni. Alcune cellule endocrine rilasciano ormoni che mantengono il metabolismo della cellula ad un livello basale e la così detta ”steady-state” chimica del sangue. In particolare, un compito importante del sistema endocrino è mantenere la concentrazione di glucosio nel sangue nel range di euglicemia [80-120 mg/dl]. Sebbene le cellule endocrine coinvolte nel meccanismo di regolazione del glucosio nel sangue siano diverse, è risaputo che le beta-cellule pancreatiche che secernano l'ormone insulina sono le principali responsabili nel mantenere l'euglicemia. Infatti, l'insulina viene secreta dopo un aumento della concentrazione di glucosio nel sangue e il suo effetto è quello di indurre le altre cellule a metabolizzare il glucosio presente nel sangue, riportando la sua concentrazione sotto il valore limite fisiologico. Oltre all'insulina, ci sono anche altri ormoni che agiscono per regolare il livello di glucosio nel sangue, come gli ormoni insulinotropici dell'intestino, per esempio glucagon-like peptide-1 (GLP-1) secreto dalle L-cellule intestinali, situate nell'epitelio intestinale tra gli enterociti e altre cellule secretorie. GLP-1, insieme ad altri ormoni, è responsabile dell'effetto incretina, effetto che potenzia la secrezione di insulina indotta dal glucosio stimolata dai nutrienti nel lumen dell'intestino tenue, motivo per cui la risposta dell'insulina quando il glucosio è assunto oralmente risulta essere maggiore rispetto a quando è somministrato per via intravenosa. Sfortunatamente, si conosce ancora poco sia riguardo i meccanismi molecolari alla base dell'associazione stimolo-secrezione delle L-cellule e sia riguardo i disturbi nella secrezione dell'insulina pulsatile, pur essendo questi i primi segnali del diabete. Altre cellule endocrine invece rispondono a specifici input e rilasciano ormoni potenti a lunga durata d'azione. Un sottogruppo di questo tipo di cellule è l'insieme delle cellule endocrine della ghiandola pituitaria (somatotrope, lactotrope, tirotrope, gonadotrope, corticotrope). Queste cellule secernono ormoni quando stimolate dall'ipotalamo. Gli ormoni così secreti agiscono su altre ghiandole endocrine e altri tessuti, incluso il cervello, per regolare ad esempio la crescita, la riproduzione, il comportamento, la temperatura, e l'assorbimento di acqua. Data l'estrema importanza del sistema endocrino e il bisogno di capire più in profondità l'associazione stimolo-secrezione in queste cellule, in questa tesi verrà utilizzata una combinazione di dati sperimentali e modelli matematici proprio con l'obiettivo di studiare i meccanismi alla base di questo meccanismo. Tutte le cellule endocrine eccitabili condividono delle caratteristiche comuni per indurre l'esocitosi: si depolarizzano dopo l'esposizione allo stimolo, i canali di calcio voltaggio dipendenti si aprono, permettendo l'ingresso del calcio all'interno della cellula; l'aumento della concentrazione di calcio induce la fusione delle vescicole che sono ancorate alla membrana rilasciando il loro ormone all' esterno della cellula. In questa tesi verranno analizzati i meccanismi cellulari implicati nel processo di stimolazione della cellula associato all' esocitosi nelle tre categorie rappresentative di cellule endocrine eccitabili (beta-cellule pancreatiche, L-cellule intestinali e cellule pituitarie), utilizzando una combinazione di dati sperimentali e modelli matematici. Per quanto riguarda le beta-cellule, il lavoro presentato si focalizza sull'effetto delle sostanze ossidative sulle oscillazioni del calcio intracellulare, responsabile dell'esocitosi. Le sostanze ossidative e nitrogene, ROS e NOS, rispettivamente, sono prodotti cellulari che si formano durante la catena di trasporto degli elettroni nei mitocondri. In particolare, si è visto che ROS/NOS portano a disturbi nella secrezione di insulina e al danneggiamento delle beta-cellule. Tuttavia, è stata anche attribuita a queste sostanze un effetto a breve termine di stimolazione del rilascio di insulina. Per studiare questo duplice effetto e i meccanismi cellulari coinvolti, è stato adattato un modello matematico esistente relativo alle oscillazioni di calcio nelle beta-cellule alle cellule MIN6, una linea pancreatica di beta-cellule, ed è stato usato per interpretare i risultati sperimentali. I risultati sperimentai e del modello suggeriscono, presumibilmente, un collegamento tra ROS/NOS e i disturbi della secrezione di insulina pulsatile. Nello specifico, livelli moderati di NOS/ROS agiscono a livello di gestione del calcio del Reticolo Endoplasmatico, mentre livelli maggiori di ROS/NOS spesso hanno come target altre componenti che sono responsabili del comportamento oscillatorio. Il lavoro in seguito si sposta in direzione delle cellule pituitarie, per le quali analizziamo l'effetto di associazione stimolo-secrezione generato da due comportamenti tipici elettrici delle cellule pituitarie: spiking continuo e il così detto “pseudo-plateau” bursting. I dati sperimentali mostrano che al pattern del bursting è associata un'ampiezza maggiore delle fluttuazioni del Ca2+ rispetto alle fluttuazioni con spiking. Questa osservazione porta a formulare l'ipotesi che quando le cellule fanno bursting rilasciano una quantità maggiore di ormone. Sfortunatamente, testare questa ipotesi e misurare il livello di ormone secreto è difficile sia per le piccole dimensioni della cellula (dimetro <10 µm) che per la necessità di usare popolazione di cellule che può comprendere sia cellule che fanno bursting che cellule che fanno spiking. Per questo motivo, usiamo simulazioni per valutare questa ipotesi. I dati elettrofisiologici sperimentali dei due pattern misurati nella stessa cellula sono stati utilizzati come ingresso ad un modello matematico per l'attività stocastica del singolo canale di Ca2+. L'apertura stocastica del canale di calcio viene poi utilizzata per simulare la diffusione di Ca2+ associata utilizzando il programma CalC (Calcium Calculator). In seguito, i profili di Ca2+ ottenuti nella regione appena sotto la membrana a varie distanze dal canale di calcio vengono utilizzati per guidare un modello di esocitosi ed ottenere la quantità di ormone rilasciato corrispondente. Sono stati presi in considerazione sia uno scenario in cui i canali di Ca2+ sono distribuiti singolarmente tra la superficie della cellula, sia il caso in cui sono distribuiti suddivisi in cluster e variando la distanza dei canali dal sito di rilascio. Abbiamo trovato che bursting è sempre almeno tanto efficace ad indurre esocitosi quanto spiking e spesso è più efficace, anche quando viene normalizzato per la quantità di Ca2+ entrante. Dalla diffusione del calcio e la secrezione nelle cellule pituitarie, abbiamo spostato il nostro interesse al meccanismo di assorbimento del glucosio e secrezione ormonale nelle L-cellule intestinali. È stato sviluppato il primo modello spazio-temporale delle L-cellule, in particolare è stata modellata l'attività elettrica, le principali correnti e altri meccanismi quali il trasporto del glucosio all'interno della cellula attraverso i trasportatori SGLT1 e GLUT2 e la sua diffusione all'interno della cellula; il flusso di calcio associata alla corrente del calcio e diffusione; il flusso del Na+ e diffusione all'interno della cellula, e la produzione e l' utilizzo dell'ATP. Questo sistema di simulazione viene utilizzato per capire meglio i meccanismi delle L-cellule, focalizzandosi sul trasporto del glucosio all'interno della cellula sulla relazione tra glucosio e secrezione di GLP1. In conclusione, in questa tesi sono stati esaminati e studiati attraverso modelli matematici i principali meccanismi che portano all'esocitosi ormonale delle cellule endocrine. Un sottogruppo rappresentativo di cellule endocrine, beta-cellule, cellule pituitarie e L-cellule, è stato esaminato, ponendo l'attenzione sui diversi aspetti legati all'accoppiamento specifico stimolo-secrezione. Per ogni tipo di cellula, sono stati sviluppati o adattati dei modelli matematici che sono stati poi utilizzati per spiegare ed interpretare i risultati osservati sperimentalmente. Infatti, gli esperimenti possono avere dei limiti dovuti a diversi fattori come la necessità di dover utilizzare delle specifiche sostanze inibitorie o alla mancanza di una tecnologia appropriata, o all'impossibilità di isolare alcuni specifici meccanismi di interesse. È proprio in questi casi che i modelli matematici risultano essere uno strumento necessario e indispensabile per lo studio dei meccanismi biologici.