Studio dell'Espressione della Protimosina-Alfa nelle Cellule Germinali Meiotiche e Post-Meiotiche Durante La Prima Ondata Spermatogenetica di Ratto e Negli Spermatozoi Epididimali

La protimosina-α (PTMA) è una proteina acida di piccole dimensioni, studiata per la prima volta nel timo di ratto quale fattore immunogeno (Haritos et al., 1984a), e in seguito identificata in molteplici tessuti dei Mammiferi, tra cui il cervello, il cuore, i reni, e le gonadi (Haritos et al., 1984b; Clinton et al., 1989). La proteina è filogeneticamente conservata: la sua presenza è stata confermata in ogni Mammifero finora studiato, mentre, solo di recente, è stata scoperta in un ristretto numero di Vertebrati non mammiferi, quali Rana esculenta, (Aniello et al., 2002), Danio rerio (Donizetti et al., 2008) e Torpedo marmorata (Prisco et al., 2009). Le atipiche caratteristiche strutturali di PTMA favoriscono l’assunzione di una conformazione nativa random-coil (Gast et al., 1995), che le consente di interagire con numerose molecole di natura cationica. Ciò, insieme alla sua localizzazione, che si estende dal nucleo al citoplasma fino ai distretti extracellulari (Enkermann et al., 2000b, Mosoian, 2011), giustifica la sua partecipazione in una elevata varietà di processi biologici. Tra le innumerevoli funzioni associate a PTMA vi sono la proliferazione cellulare, il rimodellamento della cromatina (tramite il legame all’istone H1), l’attivazione trascrizionale, la difesa dai sistemi di morte cellulare, e la trasformazione neoplastica, ruoli che sono stati spesso spiegati con l’ipotesi del mimetismo molecolare. Pochi studi finora hanno affrontato il possibile coinvolgimento di PTMA nella riproduzione, precisamente nella gametogenesi maschile: i primi riscontri hanno suggerito che la proteina possa essere associata alle fasi proliferative e alle prime fasi meiotiche della spermatogenesi dei Mammiferi (Rosón et al., 1990). In seguito, il nostro gruppo ha dato inizio a un progetto di tipo comparativo sulla spermatogenesi dei vertebrati e ha riportato, per la prima volta, l’isolamento della protimosina in una specie non-mammifera, l’Anfibio Rana esculenta (Aniello et al., 2002): il trascritto di ptma è espresso ad alti livelli durante il ciclo riproduttivo annuale della rana, con un picco in Settembre/Ottobre, quando sono in corso le meiosi e le prime fasi della spermiogenesi, ed è localizzato negli spermatociti III (SPC) I e II, e nelle cellule di Leydig (LC; Aniello et al., 2002). Analogamente, la proteina è stata rilevata nel compartimento germinale, dagli SPCII agli spermatozoi (SPZ) e nelle LC (Ferrara et al., 2009). Recentemente, è stato evidenziato un pattern corrispondente nel pesce selaceo Torpedo marmorata. I nostri dati suggeriscono, dunque, che PTMA sia associata alle fasi meiotiche e post-meiotiche della spermatogenesi dei vertebrati. Allo scopo di proseguire gli studi comparati e di valutare la possibile conservazione del pattern nei mammiferi, nel presente testo abbiamo studiato la correlazione tra PTMA e le fasi meiotiche e post-meiotiche della spermatogenesi di ratto. Per prima cosa abbiamo confermato la presenza del messaggero e della proteina nei testicoli di esemplari adulti, poi ci siamo soffermati sulla prima ondata della spermatogenesi, analizzando gonadi di giovani ratti prelevate a tre tempi di sviluppo, ognuno valido per l’osservazione approfondita di specifiche cellule germinali (CG): 27 giorni dopo la nascita (dpp), momento in cui le meiosi sono state completate per la prima volta; 35 dpp, durante la spermiogenesi; 60 al termine della prima ondata, quando il testicolo è ormai maturo. I nostri dati mostrano che sia i livelli di espressione dell’mRNA di Ptma, sia della proteina subiscono una riduzione da 27 a 60 dpp. L’ibridazione in situ ha permesso di localizzare il trascritto nelle LC e nelle cellule peritubulari mioidi (PMC) e, nei tubuli, dagli SPC in pachitene agli SPT aploidi di nuova formazione. L’analisi di immunoistochimica ha mostrato che la proteina si trova negli stessi tipi cellulari a 27 dpp, mentre nel compartimento germinale a 35 e a 60 dpp è rilevabile solo nelle cellule aploidi (Ferrara et al., 2010). Ulteriori indagini hanno mostrato che PTMA è associata al sistema acrosomale durante tutto il processo di biogenesi, fino alla sua destinazione perinucleare nella testa dello SPZ, come supportato da studi di immunofluorescenza su gameti maturi di ratto e uomo. Pertanto, i nostri dati rivelano, per la prima volta, che PTMA potrebbe avere un ruolo diretto nella maturazione degli SPZ dei Mammiferi, o addirittura concorrere alla realizzazione degli eventi successivi della fecondazione.