Genetic control of moulting and segmentation during post-embryonic development in Lithobius peregrinus (Chilopoda, Lithobiomorpha)

La grande diversificazione nell’organizzazione del piano corporeo degli artropodi fa di questo gruppo un taxon molto interessante per lo studio dell’ evoluzione dei modelli di sviluppo. Negli ultimi decenni, gli studi di genetica dello sviluppo si sono focalizzati principalmente sulla fase embrionale in diverse specie di artropodi, mentre lo sviluppo post-embrionale è stato raramente studiato solo in alcune specie modello. In molti artropodi lo sviluppo postembrionale è caratterizzato da un aumento del numero dei segmenti del tronco. Nei centopiedi litobiomorfi, l’animale emerge dall’uovo con soli sette segmenti del tronco perfettamente formati raggiungendo poi, al termine delle prime cinque mute, l’assetto definitivo con quindici segmenti pediferi. Questo tipo di sviluppo viene detto emianamorfico. In queste specie, nonostante ci siano ampie variazioni intraspecifiche nel tasso di crescita e nella scansione delle mute, ogni stadio anamorfico è caratterizzato da un precisa composizione segmentale del corpo. Crescita, muta e segmentazione sono quindi processi di sviluppo strettamente correlati ed è facilmente ipotizzabile che la variazione (e la capacità di evolvere) di ciascun processo sia strettamente dipendente dalla precisa relazione con gli altri. L’ obiettivo di questa ricerca è stato lo studio dei processi di muta e di segmentazione durante lo sviluppo postembrionale nel centopiedi Lithobius peregrinus, utilizzando un approccio molecolare. Negli artropodi, la muta è controllata dall’oscillazione dei livelli dell’ecdisone. A livello molecolare, questo ormone svolge la sua funzione regolativa legandosi ad un complesso eterodimerico formato da due recettori nucleari: il recettore dell’ecdisone (EcR) e il recettore X retinoico (RXR), omologo del recettore ultraspiracle (USP). Negli insetti, il complesso EcR/USP regola direttamente i geni target primari dell’ecdisone, tra i quali Broad-Complex (BR-C), E74 ed E75. Questi geni codificano fattori di trascrizione che mediano ed amplificano il segnale ormonale regolando un ampio assortimento di geni target secondari coinvolti nel passaggio larva-pupa.(review in Thummel, 1995; King-Jones & Thummel 2005). In questo studio sono state clonate sequenze parziali dei geni omologhi EcR e RXR in L. peregrinus (LpEcR and LpRXR) ed è stato analizzato il loro profilo d’espressione durante il secondo stadio larvale (L1). Un confronto delle sequenze di LpEcR and LpRXR con sequenze ortologhe in altri artropodi ha evidenziato un’elevato livello d’identità con i chelicerati e gli insetti etero metaboli (68-81%), mentre con i crostacei e gli insetti olometaboli meno derivati (65-70%) l’identità è leggermente inferiore. Una caratteristica di L. peregrinus è la presenza di più varianti di sequenza per entrambi i recettori: sono state identificate due isoforme per EcR e tre isoforme per RXR. Ulteriori analisi saranno necessarie per chiarire un eventuale diversa funzione di queste varie isoforme. Il profilo d’espressione osservato per LpEcR e LpRXR durante lo stadio L1 è simile. I livelli d’espressione di entrambi i geni aumentano nella seconda parte dello stadio, e ciò suggerisce che il processo di muta in questo stadio inizi dopo circa 48 ore dalla precedente ecdisi. I risultati ottenuti sono in linea con quanto è stato osservato in altri artropodi. Il mancato riscontro di un ortologo del gene Broad-Complex in L. peregrinus e nei crostacei (B. Konopova, comunicazione personale) fa supporre che si tratti di un’apomorfia degli insetti. Le basi genetiche dei meccanismi di sviluppo della segmentazione sono stati ampiamente studiati nel moscerino della frutta Drosophila melanogaster. I cosiddetti ‘geni della segmentazione’ in Drosofila sono stati classificati in geni ‘gap’, ‘pair-rule’ e ‘segment-polarity’. Questi geni occupano diversi livelli gerarchici nella cascata di regolazione genica della segmentazione: a monte ci sono i geni ‘gap’, successivamente i geni ‘pair-rule’ ed i geni ‘segment-polarity’. Questi ultimi (come engrailed, wingless, hedgehog and cubitus interruptus) codificano proteine che vengono espresse nell’embrione con periodicità segmentale e che sono richieste per la corretta formazione del pattern di strutture entro ciascun segmento. Geni omologhi dei geni ‘pair-rule’ e ‘segment-polarity’ sono stati studiati in diversi insetti, nei chelicerati, nei crostacei e nei miriapodi, ma mancano informazioni basilari sulla loro espressione durante la segmentazione postembrionale. In questa ricerca è stata studiata l’espressione di due geni ‘segment-polarity’, engrailed e wingless, già coinvolti nella segmentazione embrionale dei centopiedi, per stabilire il loro ruolo nella segmentazione durante la fase anamorfica dello sviluppo. E’ stato così dimostrato che in L. peregrinus, en e wg sono intensamente espressi durante l’anamorfosi. Solamente en sembra conservare un ruolo nella segmentazione postembrionale, sebbene con modalità d’espressione diverse, mentre wg sembra legato allo sviluppo del sistema nervoso e degli abbozzi degli arti, e non presenta espressione periodica. Questo suggerisce che questo gene non svolga più nel processo di segmentazione il ruolo che aveva durante lo sviluppo embronale. Questa ricerca segna inoltre un avanzamento metodologico significativo: per la prima volta in un centopiedi sono stati messi a punto i protocolli di due tecniche di biologia molecolare molto importanti: la Real Time PCR e l’ibridazione in situ su sezioni di paraffina. I risultati di questo studio sull’anamorfosi di Lithobius peregrinus rappresentano i primi dati molecolari disponibili sullo sviluppo postembrionale di un miriapode e rappresentano un importante punto di partenza per lo studio dello sviluppo e dell’evoluzione dei processi di muta e segmentazione in una fase dello sviluppo ancora poco conosciuta.