Structure and structural dynamics of Photosystem II supercomplex in higher plants

La fotosintesi è indubbiamente il processo biologico principale che introduce energia chimica e biomassa negli ecosistemi ossidando l’acqua e riducendo l'anidride carbonica in composti organici. Il fotosistema II (PSII) è un complesso proteico presente nelle membrane tilacoidali di tutti gli organismi fotosintetici, l’unico in grado di catalizzare la reazione di lisi dell'acqua utilizzando la luce solare come forza motrice e di conseguenza responsabile della generazione di tutto l'ossigeno molecolare presente nell'atmosfera da più di tre miliardi di anni. Nonostante il centro catalitico del PSII sia rimasto fondamentalmente inalterato nel corso dell'evoluzione dai cianobatteri alle piante superiori, la necessità di far fronte alla continua variazione delle condizioni di luce ambientali ha portato all’evoluzione di sistemi di antenne periferiche altamente differenziate, distinte in ficobilisomi estrinseci nei cianobatteri e complessi di membrana intrinseci (LHCII) in alghe verdi e piante superiori. Gli LHCII sono complessi proteici di membrana presenti come etero-trimeri composti dalle subunità Lhcb1-2-3 e subunità monomeriche Lhcb4-5-6 associate perifericamente con il centro catalitico del PSII in numero variabile, formando così associazioni supramolecolari chiamate supercomplessi PSII-LHCII. L'unità funzionale minima, presente in ogni condizione di luce, detta C2S2, è costituita da un PSII centro di reazione dimerico (C2) legato strettamente a due complessi antenna trimerici (S2), composti da Lhcb1 e Lhcb2, mediante due subunità monomeriche Lhcb4 e Lhcb5. In condizioni di luce limitante il C2S2 può ulteriormente associare uno o due complessi antenna trimerici legati moderatamente (M2), costituiti dalle subunità Lhcb1, Lhcb2 e Lhcb3, mediante una peculiare subunità monomerica che si trova solo nelle piante superiori, Lhcb6, generando supercomplessi di tipo C2S2M1-2. I supercomplessi PSII-LHCII possono ulteriormente interagire lateralmente all'interno del piano della membrana tilacoidale formando megacomplessi PSII-LHCII o più estesi arrangiamenti ordinati semicristallini. I complessi antenna LHCII svolgono un duplice ruolo, la dissipazione efficiente dell'energia luminosa, spesso in eccesso negli ambienti naturali, e l’ottimizzazione della sua raccolta negli ambienti in cui vi è concorrenza tra organismi e ombreggiatura reciproca. Il riassetto del sistema di antenne modulari del PSII attraverso la sua interazione dinamica con il centro catalitico sembra quindi essere un processo chiave nella regolazione della raccolta della luce. Inoltre, i PSII e LHCII nelle piante sono spazialmente e funzionalmente segregati in dischi impilati di membrane tilacoidi (grana), dove occupano l'80% della superficie. La loro disposizione strutturale in supercomplessi PSII-LHCII che interagiscono dinamicamente tra loro sembra essere determinante per l'architettura complessiva della membrana tilacoidale e quindi per l'efficienza della fotosintesi. Sebbene la struttura del supercomplesso base C2S2 delle piante sia stata recentemente risolta ad una risoluzione quasi atomica, c'è ancora una lacuna conoscitiva riguardo al ri-arrangiamento strutturale dei PSII-LHCII che avviene in diverse condizioni di luce e alla loro interazione reciproca nel piano della membrana e tra membrane adiacenti dei grana. Durante il lavoro svolto in questa tesi, siamo stati in grado di purificare super- e megacomplessi PSII-LHCII isolati da piante di pisello coltivate in luce moderata mediante la completa solubilizzazione delle membrane tilacoidali. La caratterizzazione biochimica dei supercomplessi PSII-LHCII isolati, complementata da accurate analisi proteomiche, è stata accoppiata con studi strutturali al fine di comprendere la loro architettura funzionale. La caratterizzazione strutturale, eseguita mediante microscopia elettronica a trasmissione (TEM) in condizioni criogeniche (cryo-EM) e successiva analisi d’immagine sulle singole particelle, ha portato ad una nuova struttura tridimensionale (3D) a circa 14 Å di risoluzione del supercomplesso di tipo C2S2M. La mappa di densità elettronica ottenuta ha rivelato che, in condizioni di luce di crescita di intensità moderata, la maggior parte dei supercomplessi è di tipo C2S2M. Essi sono disposti in maniera accoppiata, interagendo mediante collegamenti fisici attraverso l’intervallo stromatico, verosimilmente di membrane adiacenti. La sovrapposizione specifica degli LHCII trimerici, uno di fronte all'altro in supercomplessi accoppiati, come già osservato in altri studi, suggerisce che questa conformazione potrebbe essere rappresentativa del loro stato nativo all'interno delle membrane. I collegamenti fisici osservati nell’intervallo stromatico potrebbero essere attribuibili all'interazione reciproca tra le lunghe porzioni N-terminali di subunità monomeriche Lhcb4 adiacenti. Queste subunità occupano una posizione chiave nella mappa 3D dei supercomplessi accoppiati e le densità elettroniche che attraversano l’intervallo stromatico connettendo i due supercomplessi sono chiaramente attribuibili alle loro porzioni flessibili N-terminali. La sequenza amminoacidica di questa regione, nonostante la sua flessibilità, è sorprendentemente conservata anche in organismi fotosintetici filogeneticamente distanti, il che suggerisce un suo coinvolgimento in dinamiche strutturali fisiologicamente rilevanti per l’apparato fotosintetico. L'interazione specifica osservata nei supercomplessi appaiati sembra essere mediata dai cationi presenti all'interno del cloroplasto in concentrazioni fisiologiche. La loro rimozione dai tamponi utilizzati per l'isolamento, infatti, ne provoca la dissociazione in singoli supercomplessi. Questa evidenza è inoltre sostenuta dalla stima della connettività funzionale misurata in-vivo tramite tecniche di induzione di fluorescenza. Nei supercomplessi appaiati infatti si è evidenziato un potenziale trasferimento di energia maggiore se confrontato con i supercomplessi singolarizzati mediante semplice diluizione dei cationi presenti. L’ appaiamento sul lato stromatico mediato da cationi è stato osservato anche in forme isolate di PSII-LHCII con forme di oligomerizzazione superiore ai supercomplessi, in cui due supercomplessi accoppiati interagiscono lateralmente tra loro nel piano di membrana, formando così megacomplessi appaiati. Questa nuova struttura è stata ottenuta con TEM e ricostruzione bidimensionale a partire da particelle colorate negativamente. Nonostante la bassa risoluzione ottenuta, questa struttura rivela come i supercomplessi PSII-LHCII possono interagire reciprocamente in modi diversi, sia lateralmente che attraverso l’intervallo stromatico. L'osservazione della potenziale sovrapposizione degli LHCII trimerici in megacomplessi accoppiati, così come la presenza di diverse geometrie di interazione tra supercomplessi all'interno del piano di membrana e tra megacomplessi nelle membrane adiacenti, forniscono informazioni interessanti su come PSII e LHCII potrebbero interagire in modo stabile e specifico all'interno della membrana tilacoidale e tra i vari dischi dei grana. Al fine di studiare il rimodellamento dei supercomplessi PSII-LHCII nel contesto di un continuo cambiamento delle condizioni ambientali di luce, sono stati isolati supercomplessi PSII-LHCII da piante di pisello cresciute a diverse intensità di luce: bassa (LL), moderata (CL) e alta (HL). La valutazione in-vivo delle dimensioni dell'antenna funzionale del PSII (ASII) è stata accoppiata con l’identificazione e la quantificazione, mediante analisi proteomiche, delle diverse subunità di LHCII presenti sia nei supercomplessi isolati che nei tilacoidi nativi. All’aumentare dell’intensità di luce di crescita, si evince il rimodellamento strutturale dell’antenna modulare del PSII dovuto alla riduzione della quantità di LHCII trimerici di tipo “M” nei complessi isolati, attestata da una ridotta presenza di Lhcb3 e Lhcb6. Questo rimodellamento specifico non avviene però con le stesse modalità in tutta la membrana tilacoidale. Infatti, la quantità totale di LHCII nei tilacoidi viene significativamente ridotta solo in piante cresciute in HL, suggerendo la presenza di diverse strategie di acclimatazione in grado di ridurre l’antenna funzionale nei tilacoidi. La notevole diminuzione dell’ASII osservata sia nei supercomplessi isolati che nelle membrane tilacoidi di piante cresciute in HL, rispetto alle piante LL, può essere attribuita al significativo incremento di Lhcb4.3, una isoforma di Lhcb4. A differenza delle isoforme Lhcb4.1-2, l'isoforma Lhcb4.3, la cui trascrizione è nota aumentare in seguito all'esposizione ad HL, presenta l’estremità C-terminale troncata. Questa porzione della proteina nella struttura del supercomplesso C2S2M si trova a livello dell’interfaccia di legame con Lhcb6, la subunità monomerica che funge da connettore specifico per l’LHCII trimerico di tipo “M”. L'incorporazione di Lhcb4.3 nel supercomplesso PSII-LHCII sembrerebbe svolgere quindi un ruolo importante nel ridurre le dimensioni dell'antenna funzionale, riducendo l’affinità di legame di antenne aggiuntive (tipo “M”) per ridurre l’efficienza di raccolta della luce già ad intensità moderate. L'esposizione ad HL invece, oltre ad indurre la diminuzione dell'antenna del PSII in supercomplessi isolati, determina anche la riduzione parziale di tutte le antenne del PSII presenti nelle membrane tilacoidi, impedendo quindi danni al centro di reazione quando la luce incidente supera costantemente la sua capacità di utilizzarla efficientemente. Questi risultati contribuiscono ad aumentare le conoscenze su come il sistema di antenne associate al PSII è attivamente regolata a lungo termine modulando l’espressione genica in piante acclimatate a diverse intensità di luce. La flessibilità del sistema modulare di antenne del PSII e la sua interazione strutturale con il centro catalitico, oltre ad essere fondamentale per l’architettura tridimensionale delle membrane tilacoidi delle piante, ha certamente giocato un ruolo chiave nel determinare la loro notevole diversificazione nel corso dell’evoluzione. Nel complesso questi risultati potrebbero fornire nuovi spunti per ampliare la conoscenza di come le associazioni di PSII e LHCII e la loro reciproca interazione contribuiscono a mantenere la complessa architettura delle membrane tilacoidi e quindi l'efficienza complessiva della fotosintesi in condizioni ambientali in continuo mutamento.