Mechanism of atlastin-mediated membrane fusion and identification of atlastin functional partners involved in endoplasmic reticulum dynamics using Drosophila as a model.

Riassunto La biogenesi e il mantenimento del Reticolo Endoplasmatico (ER) richiedono fusione delle membrane. La fusione omotipica delle membrane dell'ER dipende dalla GTPasi atlastina, tuttvia i meccanismi che governano il processo di fusione mediato da questa proteina sono ancora sconosciuti. Attraverso un’analisi struttura-funzione, abbiamo esaminato i meccanismi alla base del processo di fusione nucleotide-dipendente di atlastina nell’organismo modello Drosophila melanogaster. L'analisi dei domini di atlastina mostra che una regione conservata nella coda citoplasmatica C-terminale è indispensabile per la sua attività fusogena. Atlastina priva del dominio C-terminale non permette la fusione delle membrane. L’espressione di atlastina wild-type di Drosophila causa alterazione del caratteristico fenotipo reticolare dell'ER e marcatori del Reticolo evidenziano dilatazioni delle membrane reticolari di varie dimensioni. Al contrario, l'espressione di atlastina tronca della regione C-terminale non altera la morfologia del ER dimostrando che questa forma troncata è poco o non funzionale in vivo. L'espressione di atlastina tronca ha permesso di identificare un dominio intermedio costituito da un fascio di tre eliche che sono importanti per l'oligomerizzazione di atlastina. Mutazioni che distruggono la struttura delle alfa-eliche di questo dominio inattivano atlastina prevenendo l'avvicinamento e la conseguente fusione delle membrane del Reticolo Endoplasmatico. Inoltre, l’aumento della distanza di formazione del complesso di atlastina dalle membrane destinate a fondersi inibisce la fusione, suggerendo che questa distanza è cruciale per atlastina per promuovere la fusione. Recentemente è stato visto che atlastina interagisce con altre proteine coinvolte nel determinare la morfologia dell'ER appartenenti alle famiglie reticulon e REEP/Yop/DP1. I nostri studi hanno dimostrato che Dp1 e reticulon interagiscono funzionalmente con atlastina. La letalità dovuta a mutazione nulla di atlastina è recuperata dalla simultanea perdita di funzione di reticulon. Inoltre, l fenotipo di iperfusione causato da sovraespressione di atlastina in cellule COS-7 è recuperato co-esprimendo Dp1 o reticulon. Questo risultato è supportato da esperimenti nell'occhio di Drosophila. Espressione di atlastina wild type nell'occhio di Drosophila causa un occhio piccolo e rovinato. La sovraespressione simultanea di Dp1 e atlastina nell'occhio risulta nel recupero del fenotipo causato dall'espressione di atlastina. Al contrario, l'assenza di reticulon aumenta il fenotipo di occhio piccolo e rovinato dovuto a espressione di atlastina. Questi risultati mostrano una forte interazione genetica antagonistica tra atlastina e reticulon o Dp1, suggerendo che questa proteine esercitano funzioni opposte per regolare la struttura dell'ER. Ipotizziamo che un bilanciamento tra le attività di atlastina, reticulon e Dp1 sia importante nel mantenimento e nel determinare la morfologia del Reticolo Endoplasmatico.