Sviluppo di un approccio terapeutico basato su piccoli rna diretti verso i segmenti genomici codificanti la polimerasi del virus dell'influenza

I virus dell'influenza di tipo A sono in grado di infettare gli esseri umani e gli uccelli ed essendo responsabili non solo di di epidemie stagionali, ma anche di pandemie, hanno un impatto importante per la Salute Pubblica. L' insorgenza di virus influenzali resistenti ai farmaci attualmente disponibili e la mancanza di una terapia vaccinale universale sono una fonte di costante preoccupazione tanto per la popolazione umana quanto per quella animale. Pertanto, la ricerca di nuovi bersagli per lo sviluppo di approcci terapeutici / preventivi nei confronti del virus influenzale di tipo A è ancora necessaria. Lo scopo di questo studio è stato quello di sviluppare e valutare una strategia antivirale innovativa basata sul delivery in cellule eucariotiche suscettibili d’infezione da parte del virus dell’influenza di tipo A di piccoli RNA. Questi ultimi hanno come bersaglio le regioni conservate presenti al 5’ dei 3 segmenti del genoma virale codificanti la polimerasi (PA, PB1, PB2), enzima essenziale perché il virus possa replicarsi (Giannecchini S. et al., 2009- 2011). Nelle regioni bersaglio si trovano i segnali di packaging, che svolgono un ruolo importante durante le fasi di assemblaggio e gemmazione delle particelle virali nascenti (Qinshan Gao et al., 2012). A tale scopo, abbiamo sviluppato diversi vettori lentivirali esprimenti miRNA [pLenti6/V5-GW/EmGFP-miR] o antisenso-RNA [pLentilox 3.7 GFP] diretti verso i segmenti genomici PA, PB1 e PB2. Le particelle lentivirali ricombinanti, sono state prodotte trasfettando cellule umane embrionali renali (293T) con entrambi i vettori insieme ad un appropriato sistema di packaging. Leparticelle lentivirali ricombinanti sono state utilizzate per trasdurre le cellule umane di derivazione alveolare (A549) che rappresentano un ottimo modello per lo studio di molecole in grado di interferire con la replicazione del virus dell’influenza di tipo A. Le cellule trasdotte sono state quindi infettate con virus dell'influenza di tipo A di origine umana e aviaria e con un virus di tipo B. L’effetto di inibizione sul titolo della progenie virale è stato valutato mediante un test di infettività. Abbiamo dimostrato che le particelle lentivirali ricombinanti che esprimono miRNA o antisenso-RNA, trasducendo in modo efficiente la linea cellulare A549, determinano una riduzione del titolo virale che varia dagli 1 a 3 logaritmi, a seconda del virus e del bersaglio molecolare preso in esame. Al contrario, non è stata osservato nessun effetto nel caso del virus dell'influenza di tipo B. Inoltre, mutazioni all'interno delle sequenze bersaglio fanno sì che non vi siano più effetti antivirali dei vettori sviluppati, confermando la specificità dell’approccio sviluppato. I nostri dati contribuiscono alla dimostrazione che il delivery intracellualre di piccoli RNA specifici per i segnali di packaging dei geni virali codificanti la polimerasi, possono rappresentare una valida strategia terapeutica nei confronti dei virus dell’influenza umani, specialmente nell’eventualità di insorgenza di virus pandemici, e aviari.