From the anatomical study to the application of different bioengineering techniques for the creation of new vital heart valve substitutes

Tale tesi di dottorato si focalizza sugli approcci correntemente in uso per lo sviluppo di nuovi sostituti valvolari con caratteristiche di vitalità: l’ingegneria tissutale valvolare e la rigenerazione valvolare tessuto-guidata. Inoltre, mette in luce alcuni aspetti in grado di influenzare la preservazione dell’impianto, come le proprietà immunogeniche della matrice extracellulare e l’entità biologica delle popolazioni staminali nei lembi valvolari cardiaci. Le valvole semilunari porcine, come quelle di pericardio bovino, trovano largo impiego per la sostituzione di valvole non più funzionanti. Il razionale per l’impiego di esse è l’alta analogia morfologica e funzionale con le valvole umane, che le rende fonte ottimale di matrice extracellulare (ECM) per protesi bioingegnerizzate. Una volta rimossa la componente cellulare xenogenica attraverso un trattamento decellularizzante, è possibile beneficiare della trama di fibre extracellulari come supporto tridimensionale per il ripopolamento con cellule staminali umane in modo da sviluppare dei sostituti simil-autologhi. Finora, non è mai stata indagata l’influenza esercitata dalla distribuzione anisotropica delle fibre dell’ECM in ventricularis e fibrosa sull’adesione cellulare. Lembi polmonari porcini sono stati sottoposti a decellularizzazione mediante un trattamento a base di TritonX100/ Sodio Colato. L’assenza dell’epitopo alpha-Gal, altamente immunogeno per l’uomo, è stata dimostrata attraverso una doppia tecnica di fluorescenza con un’isolectina e uno specifico anticorpo monoclonale. Dopo condizionamento con siero bovino fetale e fibronectina per aumentare l’attaccamento, le cellule staminali mesenchimali del midollo osseo sono state seminate sia su ventricularis o fibrosa e mantenute staticamente in vitro per 30 giorni. Non solo la ventricularis favorisce una maggiore adesione, ma anche un’aumentata diffusione all’interno dello stroma e un precoce differenziamento cellulare nei citotipi valvolari. Successivamente, è stata valutata l’interazione fra cellule umane e matrice decellularizzata umana, effettuando ancora una volta la semina su ventricularis. La combinazione omologa permette di ottenere una maggiore proliferazione , una diminuzione degli eventi apoptotici e un maggiore grado di maturazione del costrutto, tanto da apprezzare l’espressione di proteine tipiche del muscolo liscio proprio nella tonaca di pertinenza, la vetricularis. L’ECM effettua quindi un ruolo essenziale per l’integrazione cellulare fornendo segnali specifici per l’acquisizione del fenotipo valvolare corretto. Un’ulteriore ipotesi per l’ottenimento di nuovi sostituti vitali può essere rappresentata dalla rigenerazione tessuto-guidata, favorita in vivo dall’ECM in grado di esercitare un ruolo attrattivo e di guida per le cellule dell’ospite. Radici aortiche decellularizzate sono state impiantate in minipig per mimare la ricostruzione del tratto di efflusso del ventricolo destro e la funzionalità valvolare è stata monitorata ecocardiograficamente per 12-14 mesi, rivelando un progressivo miglioramento della funzione. Un ripopolamento continuo può essere osservato attraverso le analisi ex vivo negli espianti, anche se le regioni meno esposte al flusso sanguigno sono ancora prive di cellule. Le osservazioni sulle colture primarie dei tessuti parietale vascolare e del lembo portano a ipotizzare il contributo di due maggiori fenotipi al ripopolamento: cellule muscolari lisce dell’arteria polmonare e cellule staminali mesenchimali mobilizzate. Particolarmente importante non è solo la creazione, ma anche il mantenimento del biocostrutto: una volta che si è ripristinata la funzione, perciò, è essenziale comprendere i reali effettori cellulari coinvolti nella disfunzione valvolare per prevenire il fenomeno già nelle prime fasi. Scarsamente studiate, eventuali popolazioni cellulari staminali a livello valvolare potrebbero partecipare al rimodellamento tissutale omeostatico, ma anche a eventi patologici avversi. Homograft valvolari aortici (n=27) con annesso lembo anteriore della mitrale (n=27) sono stati classificati in 5 gruppi a seconda della fascia d’età di appartenenza del donatore (10-60 aa). In aggiunta, sono stati esaminati anche lembi aortici e mitrali (n=10), rimossi in sede di sostituzione valvolare. Criosezioni di tessuto cuspidale sono state sottoposte all’analisi istologica classica, istochimica (von Kossa, Oil Red O) e immunoistochimica per marker di cellule differenziate, citotipi calcificanti precoci, flogosi e cellule staminali di vari lineages. All’aumentare dell’età, il tipico aspetto osservato é l’accumulo di lipidi, sottoforma di piccole gocce nella tonaca sottoventricolare o depositi di colesterolo nella fibrosa. Il riscontro di calcificazioni è raro. Gli epitopi delle cellule staminali sono espressi nel lembo valvolare a rivelare una precisa distribuzione spaziale. Le colture primarie ottenute da questi campioni mostrano un fenotipo e proprietà di transdifferenziazione, caratteristiche di un possibile progenitore mesenchimale, senza tuttavia apparente induzione all’osteogenesi. Ulteriori studi sono necessari per meglio comprendere il coinvolgimento di tali cellule nella patologia valvolare. Concludendo, entrambe le modalità considerate per la realizzazione di un nuovo sostituto vitale sembrano validi strumenti a raggiungere lo scopo, basandosi su matrici decellularizzate prive di alpha-gal e prontamente colonizzabili. Esperimenti futuri e l’applicazione di nuove strategie biomimetiche potranno sicuramente migliorare i risultati incoraggianti finora ottenuti. Sono state inoltre proposte per la prima volta nuove informazioni sulla biologia cellulare staminale della valvola cardiaca con importanti conferme sul processo di continuo rimodellamento cellulare a carico del tessuto cuspidale.