The role of MCU in vertebrate development and physiology using zebrafish (Danio rerio) as a model organism

I mitocondri svolgono un ruolo fondamentale nel controllo dei segnali Ca2+ cellulari. Essi infatti accumulano Ca2+ in seguito al suo rilascio dai depositi, prevenendone l’eccessivo accumulo nel citosol. Il Ca2+ che entra nell'organello svolge un ruolo chiave nel regolare il metabolismo, stimolare la respirazione e quindi la produzione di ATP, nonché controllare l’attivazione delle vie di sopravvivenza e morte cellulare. L’identificazione del gene per l’uniporto mitocondriale del calcio (MCU) ha permesso la caratterizzazione molecolare del ruolo del Ca2+ mitocondriale nell’omeostasi cellulare e tessutale. Il primo modello di topo MCU-/- descritto nel 2013 dimostrava un fenotipo relativamente lieve, ma la sua severità dipende grandemente dal genotipo considerato, il che suggerisce un ruolo di MCU durante l'embriogenesi. Questo lavoro di tesi si è focalizzato sulla caratterizzazione del ruolo di MCU durante lo sviluppo dei vertebrati, impiegando lo zebrafish (Danio rerio) come animale modello. Utilizzando un approccio di genetica inversa, l’espressione di Mcu è stata silenziata mediante l’iniezione di oligonucleotidi morfolino antisenso specifici per mcu (mcuMO) in uova di zebrafish fecondate. I morfanti mcu non dimostrano evidenti alterazioni morfologiche e i loro mitocondri appaiono normali, nonostante l’espressione di Mcu sia minima e i transienti di Ca2+ mitocondriali risultino drammaticamente ridotti. I morfanti mcu presentano solo ridotte dimensioni e una significativa diminuzione dell'attività locomotoria, probabilmente legata ad alterazioni del tessuto muscolare scheletrico. Gli embrioni silenziati per mcu, infatti, presentano anomalie nella morfologia e distribuzione dei diversi tipi di fibra muscolare, perdita dell’organizzazione miofibrillare sarcomerica dovuta ad un compartimento sarcoplasmatico allargato, e cambiamenti ultrastrutturali nelle cristae mitocondriali rispetto ai controlli. Inoltre, l'analisi della popolazione motoneuronale nei morfanti mcu a 48 hpf ha evidenziato una riduzione del numero di motoneuroni e una diminuita ramificazione dei loro assoni. Dato che muscolo scheletrico e componente motoneuronale hanno uno sviluppo strettamente interconnesso durante l'embriogenesi e una popolazione di cellule muscolari, chiamate “adaxial”, è fondamentale per il corretto orientamento degli assoni dei motoneuroni, abbiamo analizzato la loro distribuzione in embrioni morfanti e relativi controlli. I morfanti possiedono un ridotto numero e una mislocalizzazione di queste cellule “adaxial”, il che potrebbe essere la causa dei difetti riscontrati nell’asse neuro-muscolare osservato in presenza del silenziamento di mcu. Inoltre, l’analisi del metabolismo di embrioni a 4 giorni di sviluppo ha dimostrato che i morfanti mcu hanno una respirazione, sia basale che massima, significativamente più bassa dei controlli e sono più sensibili allo stress ossidativo. Per poter studiare il ruolo di Mcu a stadi di sviluppo successivi e nell’adulto, abbiamo generato delle linee mutanti di zebrafish (mcudel14 e mcuins20) in cui l’espressione di Mcu è stabilmente abrogata, tramite la tecnologia CRISPR/Cas9. La loro caratterizzazione è attualmente in corso ma analisi preliminari confermano il fenotipo osservato nei pesci morfanti mcu. I pesci mutanti infatti raggiungono l'età adulta e sono fertili, ma mostrano riduzioni delle dimensioni corporee e alterazioni metaboliche. I nostri risultati evidenziano quindi il contributo fondamentale di Mcu e dell'accumulo mitocondriale di Ca2+ nello sviluppo dei vertebrati e, in particolare, nella regolazione del metabolismo e del differenziamento muscolare e motoneuronale durante lo sviluppo. La caratterizzazione dei mutanti mcu-/- aiuterà a chiarire ulteriormente il coinvolgimento del Ca2+ mitocondriale nella funzionalità di organi e tessuti in condizioni fisiologiche e, possibilmente, patologiche.