Role of protein kinase CK2 in the targeting of LSD1 and regulation of chromatin condensation: implication of the C-terminal segment of CK2a

La subunità CK2α contiene quattro motivi prolina diretti, localizzati al C-terminale, che sono fosforilati dalla Chinasi Ciclina Dipendente 1 (Cdk1). Queste fosforilazioni sono molto importanti per la regolazione di CK2, infatti, le cellule transientemente transfettate con un costrutto che mima costitutivamente la fosforilazione CK2αT344E/T360E/S362E/S370E (CK2α4E) mostrano come fenotipo una mitosi aberrante. I nostri dati confermano l'implicazione di CK2 nella regolazione mitotica e definiscono un preciso ruolo per CK2α fosforilata; infatti il mutante fosfo-mimetico CK2α4E è in grado di fosforilare in maniera preferenziale alcuni substrati. Uno di questi è la istone Demetilasi Lisina Specifica 1 (LSD1). LSD1 è un importante attore dell'epigenetica. Esso reprime o attiva la trascrizione del gene bersaglio mediante la rimozione di gruppi metile dalla Lisina 4 o 9 dell'istone H3. La fosforilazione di LSD1 ricombinante umana è stata confermata in vitro e le costanti cinetiche sono state determinate. Tramite analisi di spettrometria di massa sono stati identificati i residui fosforilati: Serina131, Serina137 e Serina166. Tutti i fosfositi appartengono alla regione N-terminale di LSD1 (1-178), che non è osservabile nella struttura cristallografica (AOD 179-852) e che è già stata ipotizzata come regione regolatoria. Un'analisi bioinformatica del tipo "molecular modeling" suggerisce questa regione come metastabile ed evidenzia che la Ser131, Ser137 e la Ser166 sono esposte al solvente. Per confermare l'esistenza di un'interazione funzionale tra CK2 e LSD1 sono stati generati due vettori di transfezione (pTP6-Ko/Flag-LSD1), uno con la mutazione fosfo-difettiva Ser131Ala e l'altro con la mutazione fosfo-mimetica Ser131Glu. Questi costrutti hanno permesso di confermare il ruolo chiave esercitato dalla fosforilazione di LSD1 in cellule. Mediante la tecnica "quantitative Real time PCR" alcuni mRNA modulati comunemente da LSD1 sono stati determinati, e dati riguardo l'attività dei mutanti di LSD1 sono stati raccolti. In particolare, la quantità di mRNA del fattore di trascrizione FoxA2 era ridotta dal mutante Ser131Glu, ma risultava inalterata in cellule che esprimevano il mutante Ser131Ala, in accordo con l'ipotesi che esista una relazione tra la fosforilazione della Ser131 e la trascrizione di FoxA2. Inoltre, la transfezione di LSD1 "Flaggata" ha permesso di eseguire l'immunoprecipitazione del complesso di LSD1 in cellule HEK293T. Questa procedura ha dimostrato che CK2α è un interattore di LSD1 in cellule; inoltre effettuando un saggio chinasico con [ϒ-33P]ATP sul campione immunoprecipitato, è stata rilevata la fosforilazione di LSD1 da parte di una chinasi presente nell'immunocomplesso. L'inibitore specifico di CK2, CX4945 (30 nM) riduceva la fosforilazione di LSD1 e confermava che CK2 è la chinasi responsabile di questo evento