Molecular bases of phenotypic and clinical variability in Duchenne and Becker muscular dystrophy

Le distrofinopatie sono un gruppo di malattie legate al cromosoma X in modalità recessiva, dovute a mutazioni nel gene DMD. La forma più severa, la distrofia muscolare di Duchenne (DMD), è causata da mutazioni troncanti, che provocano una completa assenza della proteina distrofina nel muscolo scheletrico e cardiaco. Al contrario, la forma allelica più mite, nota come distrofia muscolare di Becker (BMD), è causata da mutazioni che rispettano la cornice di lettura del gene, dando origine a distrofina quantitativamente e/o qualitativamente alterata. La DMD è una malattia devastante, caratterizzata da una progressiva degenerazione del tessuto muscolare, con deficit di forza e disabilità sin dall'infanzia. La storia naturale è caratterizzata da perdita della deambulazione autonoma attorno all'età di 10 - 15 anni, e da ridotta aspettativa di vita a causa di complicanze respiratorie e cardiache nei giovani adulti. I glucocorticoidi (GC) possono ritardare la progressione della malattia, ma una cura definitiva non è ancora disponibile. Fra i trattamenti molecolari innovativi più promettenti, annoveriamo gli oligonucleotidi antisenso (AON) che inducono l’“exon skipping” di specifici esoni nelle mutazioni “out-of-frame”, e i composti che inducono il “readthrough” dei codoni di stop prematuri. Vi è una rilevante variabilità nella severità e velocità di progressione del deficit di forza e della degenerazione del tessuto muscolare nella DMD, che non si spiega, se non in piccola parte, in base alle diverse mutazioni patogenetiche, dal momento che tutti i pazienti presentano una completa o quasi completa assenza di distrofina. Recentemente, il nostro gruppo e altri autori hanno descritto modificatori genetici della DMD, cioè polimorfismi di singolo nucleotide (SNP) associati a espressività più o meno severa del fenotipo DMD: lo SNP rs28357094 nel promotere del gene SPP1, codificante per la citochina osteopontina, e un aplotipo codificante nel gene LTBP4 (Transforming growth factor β-Binding Protein 4). Queste varianti modulano l’espressione (SPP1) o alterano la sequenza aminoacidica (LTBP4) delle rispettive proteine, entrambe le quali sono coinvolte in vie di segnale pro-infiammatorie e pro-fibrotiche. Questi geni sono stati identificati come modificatori candidati con approcci diversi (rispettivamente, studi di profili di espressione e mappatura genomica di un modello murino). Il primo obiettivo di questa tesi è stato di ottenere una validazione indipendente dell’associazione genetica dello SNP rs28357094 nel gene SPP1 e dell'aplotipo LTBP4 con l’età di perdita della deambulazione nella DMD. Questo risultato è stato conseguito utilizzando dati raccolti nel Duchenne Natural History Study del Cooperative International Neuromuscular Research Group (CINRG-DNHS), condotto su 340 pazienti DMD in 20 Centri in tutto il mondo. In questa coorte, l’allele minore G dello SNP rs28357094 era associato a un prolungamento della deambulazione di 2 anni nei partecipanti al CINRG-DNHS che erano stati trattati con GC (p < 0.05), ma a nessun effetto nei partecipanti non trattati. Ciò suggerisce che questo SNP potrebbe essere un biomarcatore farmacodinamico di risposta ai GC. L'aplotipo omozigote “IAAM” di LTBP4, invece, era associato a un prolungamento della deambulazione di 2 anni nei partecipanti di origine europea (p < 0.05), ma non nell'intera coorte multietnica CINRG-DNHS, evidenziando la rilevanza della stratificazione di popolazione negli studi sui modificatori genetici. Il secondo obiettivo è stato rivolto alla identificazione di eventuali associazioni fra specifiche mutazioni DMD e perdita della deambulazione nel CINRG-DNHS. Le delezioni confinanti con l’esone 44 (e quindi eleggibili per trattamento con AON che provocano lo “skipping” di questo esone) erano associate a perdita della deambulazione più tardiva, così come la delezione degli esoni dal 3 al 7 (rispettivamente p < 0.01 e < 0.05). Questi risultati potranno avere ripercussioni rilevanti sulla prognosi e sulla progettazione di trial clinici. Come terzo obiettivo, abbiamo studiato l’età alla perdita della deambulazione come esito a lungo termine di diversi regimi di GC attualmente utilizzati nella DMD. In questo studio osservazionale, abbiamo osservato che l’uso del deflazacort quotidiano era associato perdita della deambulazione più tardiva di 2.7 anni rispetto al prednisone quotidiano (p < 0.001), un risultato inaspettato che potrebbe essere confermato da studi clinici randomizzati attualmente in corso. Come quarto obiettivo, abbiamo genotipizzato 175/340 partecipanti al CINRG-DNHS con Exome Chip, un chip di genotipizzazione che include migliaia di varianti funzionali (regolatorie e codificanti), e abbiamo condotto un “genome-wide association study” (GWAS) del fenotipo :età alla perdita della deambulazione in un sottogruppo di 109 pazienti di origine europea (o europea-americana) non imparentati fra loro. Dal momento che nessuno SNP sorpassava la soglia di significatività corretta per test multipli secondo Bonferroni, abbiamo priorizzato i risultati focalizzandoci sui geni coinvolti in vie di segnale pro-infiammatorie e pro-fibrotiche. Abbiamo identificato così uno SNP in un gene coinvolto nell'infiammazione e nell'immunità cellulo-mediata. L’associazione dell’allele minore al locus identificato con una più precoce perdita della deambulazione (p < 9.9*10-5) è stata successivamente validata in una coorte collaborativa di 660 pazienti DMD raccolta presso l’Università di Padova, il network Bio-NMD, e il network statunitense United Dystrophinopaty Project (p < 0.05). Infine, il quinto obiettivo si è rivolto alla BMD, che presenta un quadro clinico più mite, ma anche più variabile rispetto alla DMD. La maggioranza dei pazienti BMD ha delezioni che rispettano la cornice di lettura con espressione di distrofina internamente deleta. Abbiamo quantificato la distrofina tramite Western Blot, e condotto uno studio retrospettivo della perdita della deambulazione e della capacità di correre, e uno studio longitudinale di 1 anno delle funzioni motorie (“6 Minute Walk Test” [6MWT], “North Star Ambulatory Assessment” [NSAA] e “timed function tests” [TFTs]) in 69 pazienti BMD seguiti presso l’Università di Padova. Abbiamo osservato che le delezioni che terminano sull'esone 45 presentavano frequente perdita della capacità di correre, occasionale perdita della deambulazione e un franco deficit di forza, mentre altri gruppi di delezioni, come quelle che terminano sull'esone 51, o limitate al solo esone 48, presentavano una funzione muscolare migliore. Questi risultati sono rilevanti non solo per la prognosi e la consulenza genetica nella BMD, ma consentono anche di poter predire un possibile esito della terapia con AON per la DMD. Gli AON mirano infatti a riprodurre a livello di trascritto le medesime delezioni osservate nei pazienti BMD. Inoltre, abbiamo osservato che le misure funzionali 6MWT e NSAA, mutuate da studi sulla DMD e non ancora utilizzate nella BMD, sono di semplice applicazione, clinicamente rilevanti, e in grado di identificare la progressione di malattia a un anno. Questi risultati suggeriscono che esse siano appropriate misure di esito funzionale in futuri studi clinici. Complessivamente, i lavori qui presentati offrono nuove prospettive sui meccanismi di variabilità fenotipica e clinica nelle distrofinopatie, che risulteranno utili per offrire cure migliori ai pazienti affetti da queste malattie disabilitanti.