Caratterizzazione di nuovi composti antivirali contro il citomegalovirus umano e studio del meccanismo di neuropatogenocità nel herpesvirus equino di tipo 1

La famiglia Herpesviridae comprende molti virus, patogeni sia per l'uomo che per gli animali. A questa famiglia appartengono anche il citomegalovirus umano (HCMV) e l'herpesvirus equino di tipo 1 (EHV-1), che sono oggetto di questo studio. HCMV è un patogeno di enorme importanza, dal momento che esso infetta la maggior parte della popolazione mondiale. Sebbene esso causi patologie asintomatiche o benigne nei soggetti immunocompetenti, l'infezione da HCMV è causa di patologie molto gravi (come gastroenteriti, polmoniti, retiniti, ecc.) che possono risultare anche fatali nei pazienti immunocompromessi, come trapiantati, affetti da AIDS e immunodepressi. Inoltre, HCMV è anche la prima causa di malformazioni e difetti congeniti nei neonati. Attualmente esistono alcuni farmaci approvati per il trattamento delle infezioni da HCMV, tra cui ganciclovir (GCV), cidofovir (CDV) e foscarnet (FOS), anche se nessuno di questi è stato approvato per il trattamento dell'infezione congenita. Tali farmaci hanno tutti come bersaglio comune la DNA polimerasi virale e hanno svantaggi non trascurabili, come la scarsa biodisponibilità, la tossicità elevata a lungo termine e la bassa efficacia. Inoltre, la comparsa di ceppi di HCMV resistenti a questi farmaci sta diventando un gravissimo problema nel management dei pazienti trapiantati, aggravato dal fatto che spesso i ceppi resistenti a un farmaco sono cross-resistenti anche agli altri. Per questi motivi, negli ultimi anni sono stati fatti grandi sforzi nella ricerca di nuovi composti anti-HCMV, meno tossici, più efficaci e soprattutto con un meccanismo d'azione diverso da quello dei farmaci di cui si dispone attualmente. Uno degli obbiettivi di questo studio è stato quello di identificare e caratterizzare nuove molecole con attività antivirale, in particolare dirette contro HCMV e dotate di un meccanismo d'azione diverso da quello dei farmaci commercializzati. Per questo scopo sono stati presi in considerazione tre tipi diversi di molecole: alcuni derivati 6-amminochinolonici (6-AQ), alcuni derivati solfatati del polisaccaride K5 di E. coli e un composto (AL18) della serie AL (insieme di molecole di diversa natura chimica identificate mediante HTS come inibitori dell'nterazione tra le subunità  della DNA polimerasi di HCMV). Per i 6-AQ e i derivati di K5 è stata saggiata l'attività contro HCMV e, una volta identificate le molecole più promettenti per le loro proprietà antivirali, sono stati effettuati diversi studi per caratterizzare ulteriormente la loro attività contro HCMV e altri herpesvirus, per definire lo stadio del ciclo replicativo virale in cui essi agiscono e per chiarire a livello molecolare il loro meccanismo d'azione. Invece, per quanto riguarda AL18, sono stati effettuati studi riguardanti la specificità contro HCMV rispetto ad altri herpesvirus. Questi studi hanno portato all'identificazione di un 6-AQ, WC5, con potente attività antivirale specifica per HCMV e di due derivati solfatati del polisaccaride K5 di E. coli, K5-N,OS (H) e (L), che agiscono bloccando l'nfettività di HCMV. Inoltre si è potuto dimostrare che il composto AL18 è specifico per HCMV e che rappresenta quindi un candidato ideale per lo sviluppo di nuovi farmaci sempre diretti contro la DNA polimerasi di HCMV, ma dotati di un meccanismo d'azione diverso da quello dei farmaci attualmente utilizzati in terapia. La seconda parte del progetto riguarda EHV-1, che è un patogeno molto importante per i cavalli, essendo in grado di causare patologie che vanno dalle infezioni respiratorie, all'induzione di aborto e fino a neuropatologie che possono portare anche alla paralisi e alla morte dell'animale. Recentemente il nostro gruppo di ricerca ha caratterizzato il complesso della DNA polimerasi di EHV-1 e l'effetto che alcuni polimorfismi riscontrati in isolati virali hanno sulla sua attività enzimatica. Infatti, data la varietà di patologie indotte da EHV-1, è stato ipotizzato che esistessero diversi ceppi con un diverso potenziale neuropatogenico a causa di un diverso corredo genetico e per questo sono state comparate le sequenze genomiche di numerosi ceppi di EHV-1, con lo scopo di identificare potenziali marcatori genetici associabili al potenziale neuropatogenico. E' stato dimostrato che l'unica variazione amminoacidica (D/N752) associata al potenziale neuropatogenico si trova nella subunità  catalitica della DNA polimerasi virale ed è in grado di provocare una attenuazione generale nella virulenza del ceppo da cui viene espressa e una maggiore sensibilità della polimerasi virale a un inibitore che agisce per competizione con i substrati nucleotidici, l'afidicolina (AFC). Per questo motivo sono stati effettuati dei saggi biochimici con le due varianti polimerasiche D/N752 per determinare le costanti di affinità (KM) per i substrati nucleotidici e di inibizione (KI) per AFC, con lo scopo di evidenziare delle eventuali differenze dal punto di vista biochimico in grado di contribuire alla delucidazione del meccanismo responsabile del diverso grado di neuropatogenicità  dimostrato in vivo dai rispettivi virus. Da questi studi è emerso che la variante N752 non-neuropatogenica ha un'affinità minore per due dei substrati nucleotidici rispetto alla variante D752 neuropatogenica. Inoltre, la variante N752 ha maggiore affinità per l'inibitore AFC rispetto alla variante D752. Questi dati biochimici supportano l'ipotesi di un diverso "comportamento" biochimico delle due varianti proteiche della DNA polimerasi virale nei confronti dei loro substrati dNTPs e contribuiscono alla formulazione di un modello per spiegare le differenze nel potenziale neuropatogenico dei diversi ceppi virali.