Study and characterization of drug delivery system in regenerative medicine

Riassunto I sistemi di drug delivery (DDSs) rappresentano una tecnologia particolarmente promettente per migliorare l'efficacia in vivo e in vitro di molecole biologicamente attive con l’obiettivo di circoscriverne l’effetto su una determinata tipologia di cellule, migliorarne l’efficacia, prolungarne il periodo di emivita e ridurre la tossicità di una terapia. In questo lavoro sono stati studiati due modelli di Drug Delivery: il primo riguarda lo sviluppo di nuovi farmaci antitumorali selettivi mediante un coniugato polimerico, mentre il secondo modello, che trova applicazione nell’ambito dell’ingegneria tissutale, riguarda il rilascio controllato di fattori di crescita mediante microsfere. PEG coniugato I problemi più comuni riguardanti i farmaci anti-tumorali possono essere dovuti ad un tempo di emivita basso a causa di clearance renale rapida, all'inattivazione rapida da parte di enzimi, alla scarsa selettività cellulare e spesso ad una scarsa solubilità in ambiente fisiologico, oltre a gravi effetti collaterali. Per cercare di ovviare, almeno in parte, a questi problemi, è stato preparato un coniugato polimerico direzionato al quale è stato legato un farmaco anti-cancro. Il coniugato migliora il profilo farmacocinetico del farmaco riducendo la clearance. Il “selective tumor targeting” può essere attivo o passivo. Il primo riguarda ligandi di recettori associati al tumore, che raggiungono il bersaglio sfruttando l’affinità ligando-recettore. Il secondo sistema può essere ottenuto sfruttando il cosiddetto effetto EPR (enhanced permeability and retention effect) grazie al quale molecole ad alto peso molecolare raggiungono e si accumulano nell’ambiente peritumorale. In questo lavoro è stato utilizzato un poli-(etilenglicole) eterobifunzionale legato ad epirubicina (EPI), un farmaco anti-cancro, e ad acido folico (FOL), come residuo di targeting. L'attività biologica del derivato FOL-PEG-EPI è stata studiata in due diversi sistemi di coltura, il classico sistema bi-dimensionale ed il sistema tri-dimensionale utilizzando Puramatrix hydrogelTM. Quest’ultimo dovrebbe ricreare un ambiente simile a quello in vivo. Gli studi di attività citotossica sono stati effettuati sulle seguenti linee cellulari: HT-29, MCF- 7 e KB-31 che presentano una diversa espressione del recettore di membrana per l’acido folico (rispettivamente normale espressione, medio-alta, alta). Lo studio di citotossicità su FOL-PEG-EPI ha mostrato maggiore tossicità su cellule KB-31, con sovra-espressione del recettore per l’acido folico, rispetto alle cellule MCF-7 e HT-29, sia in colture 2D che 3D. Inoltre, l’utilizzo del sistema di coltura tri-dimensionale ha dimostrato che FOL-PEG-EPI possiede attività selettiva sulle cellule KB-31, rispetto alle cellule HT-29 dove per ottenere l’IC50 è stata utilizzata una concentrazione di coniugato 3 volte più alta della massima utilizzabile in clinica. L’up-take cellulare dei coniugati ed epirubicina sono stati studiati mediante citofluorimetria e microscopia confocale. Nel primo caso, la citofluorimetria ha mostrato la presenza del segnale di fluorescenza all'interno delle cellule sia per FOL-PEG-EPI che per epirubicina. L'analisi di microscopia confocale ha confermato l’internalizzazione, localizzando in zona nucleare il farmaco libero ed in zona perinucleare il coniugato. Microsfere L’ingegneria dei tessuti è un campo interdisciplinare che applica i principi dell’ingegneria e delle scienze della vita allo sviluppo di sostituti biologici per ristabilire, mantenere o migliorare la funzione di tessuti e organi danneggiati. In questa ricerca si fondono discipline di biologia cellulare, ingegneria, scienza dei materiali e chirurgia allo scopo di costruire, mediante la combinazione di cellule, materiali (“scaffold”) e fattori di crescita, nuovi tessuti funzionali. I fattori di crescita possono essere impiegati per riprodurre le condizioni fisiologiche che consentono alle cellule di crescere, moltiplicarsi e differenziarsi nei diversi tipi di tessuti, ma la loro somministrazione rimane ancora una sfida tecnologica a causa della loro breve emivita nonché della loro difficoltà nel raggiungere il sito di targeting. La seconda parte di questo studio ha riguardato lo sviluppo di un sistema di Drug Delivery applicato all’ingegneria tissutale del tessuto osseo. La ricerca ha coinvolto l'utilizzo di un sistema di veicolazione di farmaci per il rilascio controllato della proteina TAT-OP1, che stimola la differenziazione osteogenica. Osteogenic protein-1 (OP-1 o BMP-7) è un membro della famiglia delle proteine morfogeniche dell’osso (bone morphogenic proteins, BMPs). Le BMP vengono riconosciute come fattori di crescita osteoinduttivi, ovvero promotori della formazione di nuovo tessuto osseo e appartengono alla superfamiglia del TGF-β. Le BMP sono secreti come precursori circa quattro volte più lunghi rispetto alla forma matura e possiedono una porzione C-terminale distintiva (pattern .. C ... CXGXC ... CC ... CXCX ..) contenente sette cisteine che costituiscono la regione attiva di queste proteine. In questo studio è stata utilizzata una proteina ricombinante di fusione chiamata TAT-OP1 che comprende una sequenza TAT, un peptide ricco di arginina derivante dall’HIV e che permette l’internalizzazione. Il costrutto TAT-OP1, di 162 aminoacidi, comprende: una porzione N-terminale 6 His-tag seguito dalla sequenza TAT, un sito di cleavage peptidasi-specifico (spanning 6 AA) e il C-terminale con il dominio OP-1 (126 AA) contenente il motivo di cisteine. Quando questo tipo di molecola bioattiva viene iniettato direttamente nel sito di azione, viene sottoposta ad inattivazione e rapida diluizione; questo ne limita l'uso in vivo. Per ovviare al problema sono state impiegate microsfere di poli-lattidecoglicolide (PLGA) per permettere un rilascio controllato di TAT-OP1 con l'obiettivo di mantenere un livello adeguato della proteina per tempi prolungati, migliorandone l’efficienza. Il rilascio delle molecole bioattive può essere facilmente modulato settando i parametri nella formulazione e nella tecnica di produzione. La tecnica dello spray drying è stata utilizzata per ottenere le microsfere con TAT-OP1. Il rilascio dalle microsfere con TAT-OP1 è stato studiato in un periodo di 7 giorni e l'efficienza di incapsulamento era risultata del 35%. Le dimensioni al microscopio a scansione elettronica (SEM) risultavano comprese tra 0,2-2 µm. Lo studio dell’attività biologica su microsfere con TAT- OP1, è stato condotto utilizzando pre-osteoblasti MC3T3-E1 a due diverse concentrazioni, 200 e 27 nM. Dopo 7 e 14 giorni di trattamento, le cellule mostravano presenza di mineralizzazione della matrice, test per la fosfatasi alcalina positivo e presenza di caratteristici marcatori osteogenici, quali osteopontina e osteocalcina. Questi risultati positivi ci hanno portato a valutare l'attività biologica della TAT- OP1 in microsfere in un sistema tri-dimensionale utilizzando cellule staminali mesenchimali isolate dal sangue del cordone ombelicale (UCBMSC). Il modello 3D è stata ottenuto utilizzando la matrice sintetica Puramatrix hydrogelTM, che è in grado di simulare il microambiente fisiologico. A seguito dell’incapsulazione di TAT-OP1 libera o di microsfere con TAT-OP1 in Puramatrix hydrogelTM, la risposta cellulare alla stimolazione di TAT-OP1 è stata valutata grazie all'analisi di microscopia elettronica a trasmissione (TEM) per rilevare la produzione di matrice ossea. Dopo 27 giorni di stimolazione con TAT-OP1 (200 nM), si osservava la presenza di microfibrille parzialmente aggregate attorno alle cellule. Depositi di calcio e cristalli di idrossiapatite sono stati rilevati solo in culture trattate con microsfere a rilascio controllato di TAT-OP1 (200nM). Pertanto, il rilascio controllato di TAT-OP1 da microsfere di PLGA sembra aumentare l’efficacia di stimolazione. Future indagini saranno dirette a confermare ulteriormente la capacità del presente approccio nel migliorare lo studio di differenziamento osteogenico in vitro e l'attività biologica della TAT-OP1 per un eventuale applicazione clinica nel campo dell’ingegneria tissutale dell’osso.