Transglutaminase-mediated modification of proteins: Molecular mechanisms and metal-labelling of proteins

RIASSUNTO La transglutaminasi (TGase) microbica è un enzima di 331 residui amminoacidici prodotta con metodi ricombinanti, facilmente reperibili da una fonte commerciale e ben caratterizzata in termini strutturali. La TGase catalizza la reazione tra il gruppo γ-ammidico di un residuo di glutammina (Gln) (-CONH2, accettore) ed un gruppo amminico (-NH2, donatore) di una alchil-ammina, ad es., il gruppo -amminico di una lisina (Lys). Le reazioni mediate da TGase avvengono in condizioni blande ed inoltre con notevole specificità, soprattutto per i residui di Gln. La TGase può essere utilizzata per la modifica enzimatica di proteine a livello di Gln, ma anche di Lys. Lo Schema illustra la possibilità di utilizzare nella reazione di una proteina con TGase un ligando in grado di mimare sia la catena laterale di Gln che Lys, potendo in tal modo, con opportuni ligandi, introdurre covalentemente in una proteina un gruppo fluorescente, un farmaco o anche un complesso metallo-peptide. In questa Tesi di dottorato la TGase è stata usata per la modifica di proteine modello, tra cui -lattalbumina, avidina ed apomioglobina (apoMb). Lo scopo della ricerca è stato quello di comprendere i motivi strutturali che determinano la specificità di azione della TGase. Inoltre, la modifica di proteine con TGase è stata condotta utilizzando substrati peptidici in grado di legare metalli e radionuclidi. La modifica di proteine con TGase è stata esaminata in dettaglio utilizzando proteine di struttura 3D e dinamiche note, al fine di individuare le caratteristiche conformazionali e dinamiche che determinano la modifica preferenziale o specifica. L’avidina e l’apo-α-lattalbumina sono state modificate utilizzando carbobenzoxy-glutaminyl-glicina (ZQG) (donatore) e dansyl-cadaverina (accettore). Le proteine modificate sono state purificate mediante RP-HPLC ed analizzate mediante spettrometria di massa (MS) al fine di individuare i siti di modifica. I risultati di queste analisi hanno indicato che le modifiche di queste proteine avvengono a livello di residui di Gln e Lys localizzati in regioni flessibili della loro struttura, come si deduce dai valori di fattore-B (parametro di flessibilità) della loro catena polipeptidica. Inoltre, è stato dimostrato che esiste una correlazione tra i siti di attacco di TGase ed i siti di proteolisi limitata, indicando che sia la TGase che una proteasi richiedono una certa flessibilità del substrato polipeptidico affinchè la reazione possa avvenire. Sono stati anche progettati e sintetizzati due peptidi in grado di fare complessi con metalli. Questi peptidi, contenendo una cisteina (Cys) quale residuo al C-terminale, sono in grado di coordinare metalli con il gruppo tiolo ed il gruppo carbossilico, tra cui tecnezio (99mTc) o renio (186/188Re). Inoltre, questi peptidi contenevano un residuo di Gln o Lys, ai fini di un riconoscimento da parte della TGase per la loro coniugazione covalente ad una proteina. I complessi di questi peptidi con 99mTc e 185/187Re sono stati purificati e caratterizzati in termini di proprietà leganti per i metalli ed utilizzati per la modifica di proteine. Ulteriori esperimenti sono in corso al fine di utilizzare la TGase per la modifica sito-specifica di proteine con questi metallo-peptidi, al fine di sviluppare una strategia di produzione di proteine marcate da usare per analisi di imagin.