Analisi di effetti biologici indotti dal trattamento in vitro con nanoparticelle per uso terapeutico

La terapia fotodinamica (PDT) è una modalità terapeutica minimamente invasiva utilizzata prevalentemente in campo oncologico per il trattamento di vari tipi di tumori solidi. La PDT è basata sulla somministrazione di un agente fotosensibilizzante (PS) in grado di localizzarsi preferenzialmente nei tessuti neoplastici e di generare specie altamente reattive dell’ossigeno (ROS) dopo attivazione con luce visibile di opportune lunghezze d’onda. Tali specie, in particolare l’ossigeno di singoletto (1O2), innescano una cascata di reazioni portando a danno ossidativo e morte cellulare. Una limitazione della PDT è dovuta alla natura idrofobica di molti PS che, favorendo la sua aggregazione nel mezzo acquoso, ne diminuisce fortemente l’efficacia terapeutica. Per superare tale problema e migliorare l’efficacia e la selettività della PDT, limitando gli effetti citotossici nei tessuti sani circostanti, si può trarre vantaggio dalle potenzialità fornite dalle emergenti nanotecnologie. In oncologia, infatti, le nanostrutture stanno ricevendo particolare attenzione come nanovettori iniettabili per la veicolazione selettiva di farmaci alle cellule tumorali e come agenti per l’imaging e la diagnostica delle neoplasie. Il mio progetto di Dottorato di Ricerca è stato mirato sull’utilizzo di nanosistemi idrofilici per la veicolazione della meta-tetra(idrossifenil)clorina (mTHPC, nome commerciale Foscan®, fornita dalla Biolitec), un PS idrofobico di seconda generazione con un’elevata attività antitumorale ed approvato in Europa per il trattamento palliativo di tumori della testa e del collo in stadio avanzato. In particolare, nanoparticelle di silice organicamente modificata (ORMOSIL NP, ORganically MODified SILica nanoparticles; sintetizzate presso il Dipartimento di Scienze Chimiche, Università di Padova) e liposomi rivestiti di poli(etilene glicole) (PEG) (Fospeg; forniti dalla Biolitec) sono stati studiati come sistemi di veicolazione della mTHPC. L’incorporazione della mTHPC in NP non modifica le sue proprietà fotofisiche e la sua efficienza di produzione dell’1O2 dopo irradiamento. Sono stati valutati gli effetti biologici indotti da questi nanoveicoli in cellule umane tumorali e normali confrontando la citotossicità al buio, l’efficacia fotodinamica, l’internalizzazione e la distribuzione subcellulare della mTHPC incorporata in NP rispetto alla mTHPC veicolata nel solvente standard, costituito da etanolo/PEG 400/acqua (20:30:50, v/v/v). In primo luogo, sono stati condotti studi in vitro con cellule di carcinoma esofageo umano KYSE 510, che sono state esposte a ORMOSIL NP nude, non caricate e caricate non covalentemente con la mTHPC. La citotossicità indotta al buio dalla mTHPC è stata diminuita dall’incorporazione in NP nude. La veicolazione della mTHPC in NP nude riduce l’accumulo cellulare del PS di circa il 50% rispetto al veicolo standard, ma ciò inaspettatamente non va ad influire sul grado di foto citotossicità. Infatti, le curve dose-risposta relative alla fototossicità (0.12 J/cm2 di luce rossa) della mTHPC nella forma libera e incorporata in NP sono perfettamente sovrapponibili. Inoltre, la mTHPC veicolata in entrambe le formulazioni viene internalizzata rapidamente dalle cellule KYSE 510 e si localizza preferenzialmente nell’apparato del Golgi e nel reticolo endoplasmatico. Vista la similarità dei risultati ottenuti veicolando la mTHPC in NP nude o nel solvente standard, è stata indagata la possibilità che tale PS potesse essere rilasciato dalle NP mediante due metodi: a) esperimenti di FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) condotti con NP caricate non covalentemente con la mTHPC (donatore) e con un derivato di una cianina (accettore) covalentemente legato alla matrice silanica della NP, e b) esperimenti di ultracentrifugazione con NP disciolte in diversi solventi. Solventi con polarità più bassa dell’acqua, come anche la presenza di proteine del siero, provocano il rapido e quasi totale rilascio della mTHPC dalle NP nude. Studi sulle cinetiche di monomerizzazione della mTHPC in terreno di coltura cellulare contenente siero hanno dimostrato che la mTHPC aggrega quando si trova nel veicolo standard, a differenza di quanto avviene nelle NP. Questo diverso comportamento potrebbe fornire una spiegazione della simile efficienza di fotoinattivazione, nonostante il minore accumulo della mTHPC veicolata in NP rispetto al solvente standard. Una strategia che è stata usata per cercare di evitare la fuoriuscita della mTHPC dalle NP è il rivestimento della superficie della NP con un appropriato strato di PEG. Queste “stealthy particles” sono caratterizzate da un ridotto adsorbimento di proteine sulla superficie, un lungo tempo di circolazione nei vasi sanguigni ed una minima cattura da parte dei macrofagi del sistema reticolo-endoteliale. I risultati hanno dimostrato che la PEGilazione di ORMOSIL NP riduce fortemente, ma non inibisce completamente, il rilascio della mTHPC incorporata fisicamente. Per questo motivo sono state quindi preparate delle ORMOSIL NP PEGilate caricate con la mTHPC legata covalentemente alla matrice silanica. La citotossicità al buio, l’accumulo e la distribuzione intracellulare delle NP PEGilate, non caricate e caricate fisicamente o covalentemente con la mTHPC, sono stati determinati in vitro nelle cellule A549, derivanti da un carcinoma polmonare umano, e nei fibroblasti polmonari normali umani CCD-34Lu. La linea cellulare A549 è stata selezionata in quanto è negativa per la sovraespressione del recettore del folato, e potrà essere utilizzata, in associazione con le cellule KB, che invece sovraesprimono tale recettore, in futuri esperimenti con nanoveicoli funzionalizzati con l’acido folico come ligando per l’indirizzamento specifico alle cellule tumorali. In entrambe le linee cellulari la citotossicità, al buio e dopo irradiamento, della mTHPC veicolata in NP PEGilate è in generale molto più bassa rispetto a quella della mTHPC nel solvente standard, in accordo col minore accumulo del farmaco. Nelle cellule tumorali, ma non nei fibroblasti, la riduzione della vitalità causata dall’esposizione a dosi crescenti di mTHPC incorporata in NP PEGilate è dovuta in parte alla citotossicità del nanoveicolo PEGilato non caricato. Questa differente risposta potrebbe dipendere dalla presenza di efficienti meccanismi di protezione dallo stress ossidativo nelle cellule CCD-34Lu, come suggerito dall’elevata produzione endogena di ROS in tale linea cellulare. In questo progetto sono state studiate anche varie tipologie di formulazioni liposomiali unilamellari PEGilate (Fospeg), come nanoveicoli per la mTHPC, che viene incorporata all’interno del doppio strato fosfolipidico. I liposomi utilizzati in questo lavoro differiscono per densità (2-8 mol% dei lipidi totali) e lunghezza (750, 2000, 5000) delle catene di PEG. Sono state utilizzate le cellule A549 e CCD-34Lu per valutare la tossicità al buio della mTHPC veicolata in Fospeg, confrontandola con la sua veicolazione nel solvente standard. E’ stata analizzata anche l’influenza della densità e della lunghezza della catena di PEG sull’accumulo cellulare e sull’efficacia della PDT nelle cellule in vitro. L’incorporazione della mTHPC in liposomi PEGilati diminuisce la citotossicità al buio del farmaco in entrambe le linee cellulari. L’efficienza di fotosensibilizzazione della mTHPC sulle cellule tumorali in vitro viene leggermente ridotta veicolandola in Fospeg, rispetto al solvente standard, e ciò è correlabile con l’accumulo leggermente inferiore. La microscopia di fluorescenza ha evidenziato una rapida internalizzazione della mTHPC ed una localizzazione citoplasmatica, prevalente nell’apparato del Golgi e nel reticolo endoplasmatico, in entrambe le linee cellulari, ed indipendente dalla modalità di veicolazione utilizzata (Fospeg o solvente standard). Per dimostrare se il PS venga rilasciato dai liposomi prima dell’internalizzazione cellulare, sono stati utilizzati dei liposomi PEGilati marcati con un lipide fluorescente. E’ stata osservata una localizzazione lisosomiale per la sonda Rodamina-lipide liposomiale suggerendo che la mTHPC veniva rilasciata dai liposomi. I risultati hanno dimostrato che le ORMOSIL NP ed i liposomi PEGilati possono costituire degli utili nanosistemi per la veicolazione di farmaci idrofobici e che la fuoriuscita del farmaco dai nanoveicoli può essere evitata tramite il legame covalente del farmaco. Studi futuri per migliorare l’accumulo intracellulare del PS e la selettività della terapia saranno rivolti alla funzionalizzazione superficiale di questi nanoveicoli con ligandi specificamente riconosciuti da recettori sovraespressi dalle cellule tumorali.