Isoform specific phosphorylation of p53 Ser-20 by CK1 is dictated by both a local consensus and a remote docking site

La proteina chinasi CK1 rappresenta un piccolo ed indipendente gruppo delle Ser/Thr-proteine chinasi. Ad ora, nei mammiferi sono state caratterizzate sette diverse isoforme di CK1 (α, β, γ1, γ2, γ3, δ, and ε). Inoltre, lo splicing alternativo dei geni che le codificano genera diverse varianti delle isoforme di CK1. Se da un lato le strutture cristallografiche delle isoforme δ e γ sono state risolte, non sono invece ancora disponibili informazioni strutturali dell’isoforma α. I membri di questa famiglia di chinasi partecipano a diverse funzioni biologiche tra cui si possono annoverare la segregazione cromosomica, la formazione del fuso mitotico, il ritmo circadiano, il trasporto nel nucleo, la via del segnale Wnt e l’apoptosi. Una regolazione alterata di CK1 è stata associata a diverse malattie, quali malattie neurodegenerative, tra cui le sindromi di Alzheimer e di Parkinson, la sindrome ereditaria delle fasi del sonno, l’epatite di tipo C, la leishmaniosi ed infine il cancro. Recentemente, il silenziamento trascrizionale di CK1 è stato associato alla scomparsa della formazione di metastasi. Sebbene la lista di substrati fosforilati da CK1 sia aumentata nell’ultimo decennio, le caratteristiche che contraddistinguono la specificità di substrato di CK1 sono ancora oggetto di discussione e studio. Di conseguenza, è difficile predire siti bersaglio di CK1 nei suoi potenziali substrati e valutare l’effettivo contributo di CK1 al fosfoproteoma oggi disponibile. I primi studi, per la maggior parte condotti su substrati artificiali, classificarono CK1 come una protein chinasi “fosfato-diretta” data la sua capacità di fosforilare efficacemente residui di serina o treonina caratterizzati da un residuo pre-fosforilato (fosfo-serina o fosfo-treonina) in posizione n-3, la cui funzione non viene efficacemente mimata dalle catene laterali cariche negativamente di un residuo di acido glutammico o aspartico. Questo significa che la necessità di una fosforilazione che faccia da “priming” da parte di un’altra chinasi, relegava CK1 ad esercitare la propria attività solo all’interno di meccanismi gerarchici di fosforilazione di substrati. Tuttavia, presto divenne chiaro che CK1 non necessariamente richiede un substrato pre-fosforilato, dal momento che molti dei suoi substrati fisiologici non contengono residui fosforilati, ma all’opposto svolge la funzione di chinasi “priming”, essendo necessario il suo intervento per generare sequenze consenso per altre chinasi fosfato-dirette, in particolare per GSK3. Analizzando la crescente lista di siti CK1 non pre-fosforilati, appare chiaro che solo alcuni sono caratterizzati da sequenze di residui acidi, che si sono rivelati capaci di sostituire efficacemente il singolo residuo pre-fosforilato in posizione n-3, mentre la maggior parte di essi sono da considerarsi siti non canonici la cui fosforilazione da parte di CK1 dipende da determinanti locali diversi e in alcuni casi sfuggenti. Sebbene questi determinanti locali atipici sembrano essere importanti per la fosforilazione di substrati proteici, non sono tuttavia sufficienti da soli a conferire una alta affinità per la chinasi, come dimostrano alti valori di Km ottenuti con substrati peptidici che riproducono porzioni della proteina (nell’intervallo del millimolare) se comparati con quelli ottenuti con la proteina intera. Nel caso della β-catenina, le differenze tra i parametri cinetici osservati con la proteina intera e quelli ottenuti con peptidi che riproducono parte di essa usati come substrati in esperimenti in vitro, si sono dimostrate riconducibili a siti di legame remoti situati nel primo Armadillo repeat di β-catenina, la rimozione dei quali causa un aumento di tre ordini di grandezza del valore di Km. L’obbiettivo di questa tesi è stato quello di caratterizzare la specificità di substrato della diverse isoforme di CK1 prendendo come esempio due substrati di CK1, p53 e la proteina adenomatous polyposis coli (APC), che rivestono un ruolo chiave nelle vie del segnale cellulare. L’utilizzo di proteine ricombinanti e di peptidi sintetici che riproducono la sequenza primaria della porzione fosforilabile di questi due substrati proteici, ci ha permesso di (i) ottenere maggiori informazioni sulla reale capacità delle diverse isoforme di CK1 di fosforilare singoli residui nella porzione N-terminale di p53 e di identificare sia i determinanti locali di fosforilazione su p53 sia un sito di legame legame remoto conservato sulla protein chinasi CK1 responsabile dell’alta affinità di legame di p53 con CK1δ/ε e α ma non con le isoforme γ; (ii) dimostrare che la fosforilazione multipla di APC può avvenire attraverso un meccanismo cooperativo che coinvolge le protein chinasi CK1 e GSK3. Inoltre, in collaborazione con Giorgio Cozza (Padova), attraverso tecniche di virtual-screening e saggi biochimici abbiamo identificato dei nuovi inibitori di CK1 che mostrano una alta selettività per l’isoforma δ di CK1. L’ultima parte di questa tesi riguarda lo studio di p13, una piccola proteina accessoria del virus HTLV-1. La sintesi chimica di tutta la sequenza aminoacidica di p13 ci ha permesso di caratterizzare questa proteina sia dal punto di vista strutturale che funzionale. Sono inoltre riportati alcuni dati non ancora pubblicati riguardanti il possibile ruolo della fosforilazione nella regolazione della funzione di p13.