Identification and expression studies of orthologues of vertebrate haematopoietic and neural stem cell markers in the urochordate Botryllus schlosseri

Tutti gli organismi pluricellulari originano da un piccolo set di cellule staminali embrionali totipotenti che differenziano in un piano corporeo completo durante l’embriogenesi. Queste cellule mostrano la tipica morfologia delle cellule indifferenziate con un elevato rapporto nucleo/citoplasma, pochi organelli citoplasmatici, assenza di funzioni specifiche e raggiungono il completo differenziamento attraverso stadi successivi. Le cellule staminali persistono nei tessuti durante l’intera vita dell’organismo, in diversi gradi di differenziamento, al fine di fornire cellule di ricambio in seguito a danno o morte cellulare delle cellule tissutali. Le ascidie sono invertebrati marini appartenenti al phylum dei Cordati ed al sub-phylum dei Tunicati o Urocordati, considerato sister group dei Vertebrati (Delsuc et al, 2006). Esse offrono l’opportunità di investigare e comparare il comportamento di cellule staminali adulte ed embrionali (Tiozzo et al, 2008). La presenza di cellule staminali adulte si evince da vari processi come la rigenerazione in ascidie solitarie e il ciclico ricambio generazionale nelle ascidie coloniali (Berrill, 1951). Nelle ascidie è ancora molto dibattuta la presenza di distinti progenitori staminali multipotenti che portano alla formazione della linea somatica e di quella germinale, o al contrario, di progenitori staminali pluripotenti, in grado di differenziare in entrambe le linee, in base alla nicchia in cui si trovano (Laird et al, 2005). É risaputo che in prossimità del faringe delle ascidie, sono presenti noduli emopoietici (Ermak, 1975) o aggregati cellulari contenenti cellule staminali (Rinkevich et al, 2013). L’endostilo stesso è inoltre stato identificato come una nicchia di staminalità nell’ascidia coloniale B. schlosseri (Voskoboynik et al, 2008). Dati morfologici suggeriscono la presenza di cellule circolanti indifferenziate (emoblasti) capaci di proliferare e dare origine a cellule completamente differenziate (Kawamura et al, 2006). Ulteriore evidenza della presenza di cellule staminali adulte nelle ascidie deriva da studi condotti sulla linea neurale che hanno dimostrato la presenza di progenitori neurali capaci di rigenerare il cervello in seguito ad asportazione (Bollner et al, 2009). In B. schlosseri, inoltre, si pensa siano presenti pool di cellule staminali longeve che permettono, durante il ciclo blastogenetico, la formazione del complesso neurale nelle nuove gemme (Tiozzo et al, 2009). La presenza di una riproduzione sessuata e asessuata nell’ascidia coloniale B. schlosseri, permette di comparare il processo di neurogenesi in due distinti meccanismi di sviluppo: embriogenesi e blastogenesi. Al fine di chiarire i processi di emopoiesi e neurogenesi durante il ciclo blastogenetico, ho effettuato una ricerca di geni/trascritti di marcatori molecolari di cellule staminali emopoietiche e neurali dei vertebrati da utilizzare per la ricerca di sequenze ortologhe nel genoma e nel trascrittoma di B. schlosseri. Una volta individuate queste sequenze, dopo la loro traduzione in silico, ho effettuato una ricostruzione filogenetica che, per tutti i trascritti considerati ha restituito un albero in cui gli Urocordati sono compresi in un cluster che risulta sister group dei Vertebrati. I quattro marcatori usati per l’identificazione dei progenitori emopoietici in B. schlosseri, ortologhi ai geni trovati nei mammiferi, sono bsabcg2, bscd133, bsgata1/2/3 e bsgata4/5/6. L’ibridazione in situ, effettuata mediante specifiche ribo-sonde, su strisci di emociti e su sezioni di colonie, ha permesso di osservare la presenza dei trascritti emopoietici nelle lacune emolinfatiche della regione sub-endostilare. Questi risultati coincidono con le precedenti analisi morfologiche che identificano l’endostilo come nicchia di staminalità e rinforzano l’idea che bsabcg2, bscd133, bsgata1/2/3, bsgata4/5/6 siano anch’essi marcatori di staminalità emopoietica in B. schlosseri. Con la real time-PCR si osserva un’elevata espressione dei suddetti geni nella fase di mid-cycle del ciclo blastogenetico. Durante questa fase si ha la formazione delle gemme secondarie a partire da un ispessimento della parete della gemma primaria. L’elevato livello di espressione di bsabcg2, bscd133, bsgata1/2/3 e bsgata4/5/6 nel mid-cycle può essere pertanto messo in relazione con gli eventi di proliferazione e differenziamento di cellule staminali, necessari per la formazione dei tessuti della nuova generazione blastogenetica. Per la linea neurale, ho identificato e caratterizzato due trascritti ortologhi a Sox2 e Msi2 coinvolti nel riconoscimento di precursori neurali nei vertebrati ed ho indagato, inoltre, l’espressione, durante il ciclo blastogenetico, di un pannello di geni coinvolti nello sviluppo del sistema nervoso della larva delle ascidie (bspax2/5/8, bshox1 e bshox3). L’ISH con specifiche ribo-sonde per BsSox2, BsMsi2, BsPax2/5/8, BsHox1 e BsHox3 ha mostrato una marcatura comune nella nicchia endostilare e nella regione di formazione degli stigmi nel cestello branchiale della gemma primaria. Come osservato per i marcatori dei precursori emopoietici, la presenza dei trascritti di bssox2, bsmsi2, bspax2/5/8, bshox1 e bshox3 nella regione identificata come nicchia di staminalità, ci permette di concludere che le sonde dei trascritti considerati identificano precursori staminali e che, probabilmente, in B. schlosseri sono presenti dei precursori staminali pluripotenti in grado di differenziare in progenitori emopoietici o neurali in base ai segnali ricevuti. La real time-PCR mostra un elevato livello di trascrizione di questi geni nella fase di mid-cycle. Ricordando che in questa fase si sviluppano le gemme secondarie a partire dall’ispessimento della parete delle gemme primarie, la proliferazione di cellule staminali al fine di permettere la formazione di cellule neurali, necessarie per la formazione del primordio della ghiandola neurale e del ganglio cerebrale della nuova gemma, è fenomeno indispensabile. L’aumento di espressione di bssox2, bsmsi2, bspax2/5/8, bshox1 e bshox3 nella fase in cui si sa avvenire la formazione del nuovo sistema nervoso della gemma supporta la validità di queste molecole nell’identificazione dei precursori neurali. In aggiunta a questo importante ruolo, i marcatori emopoietici e neurali considerati, rivestono probabilmente ulteriori funzioni nei tessuti di B. schlosseri come evidenziato dalla presenza di marcature aggiuntive (ovociti, tessuti di gemme primarie e secondarie, cellule morulari). Quest’ulteriore aspetto verrà approfondito in studi successivi.