Structural features of the intracellular domains of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator

La fibrosi cistica (FC) è la malattia genetica umana più comune, che si verifica prevalentemente nella popolazione caucasica con incidenza pari a 1 su 2500 neonati. È una malattia autosomica recessiva causata da mutazioni nel gene che codifica per il canale CFTR, canale del cloro espresso prevalentemente in cellule epiteliali, ma che è anche coinvolto nello scambio bicarbonato-cloruro. I sintomi FC più comuni includono la malattia polmonare progressiva e problemi cronici dell'apparato digerente (Riordan et al., 1989), il cui grado di gravità dipende da altri fattori genetici e / o ambientali. La patogenesi di FC è caratterizzata dalla formazione di muco denso e appiccicoso in diversi organi che producono mucina, come i polmoni, seni paranasali, intestino, pancreas e organi riproduttivi. Per questo motivo, FC anche denominata mucoviscidosi, poichè mucine - polimeriche, glicoproteine O-linked gelificanti responsabili delle proprietà visco-elastiche del muco, giocano un ruolo critico nella malattia (Kreda et al, 2012.). Lo scopo del presente lavoro di Ph. D è stato quello di indagare le caratteristiche strutturali dei due domini di CFTR: i domini leganti nucletidi (NBDS) - responsabili dei meccanismi di gating del canale, e che sono stati individuati essere siti bersaglio di farmaci utilizzati nella terapia di FC - e il dominio regolatorio (RD), direttamente coinvolto nell'attivazione del canale. La conoscenza di questi aspetti potrebbe probabilmente migliorare la comprensione delle funzionalità di CFTR difettosa, e anche aiutare la progettazione di strategie terapeutiche per correggere la proteina difettosa in situ, e / o potenziando l'attività fisiologica del canale. La presente tesi si riferisce essenzialmente ai quattro articoli pubblicati ed allegati che presentano la maggior parte dei risultati ottenuti durante il corso di 3 anni di dottorato. Il primo articolo tratta le caratteristiche biochimiche e strutturali degli NBD (1 e 2), che sono state studiate attraverso saggi biochimici e misure di Small Angle X-ray Scattering (SAXS), mentre il secondo articolo è relativo alla pubblicazione dei dati riguardanti lo studio dell’interazione tra gli NBD (1 e 2) e un potenziatore (2-pirimidin-7,8-Benzoflavone, PBF) dell’attività di CFTR. Invece, il terzo e il quarto articolo riportano i dati relativi allo studio di RD in condizioni non-fosforilate e fosforilate, e l'influenza della fosforilazione sulla conformazione del dominio, misurata tramite esperimenti di dicroismo circolare (CD) e esperimenti di SAXS. In sintesi, i risultati ottenuti ci hanno permesso di trarre le seguenti conclusioni principali. NBD1 e NBD2 se presenti in una miscela equi-molare formano un dimero che in presenza di ATP risulta avere una conformazione più compatta; tale conformazione può essere significativamente cambiato da PBF. Inoltre, i dati possono essere sfruttati per ricostruire il modello ab-initio di NBD1 e NBD2, sia come dimero (con o senza PBF) sia come monomeri isolati. I risultati ottenuti sulle caratteristiche biochimiche, strutturali e termodinamiche di RD, ci ha permesso di ricostruire un modello 3-D a bassa risoluzione, della proteina nativa e fosforilata, e sottolineare come la fosforilazione induca un cambiamento conformazionale del dominio e la diminuzione di stabilità di RD.