ADVANCED CHARACTERIZATION OF THE YEAST KEOPS/EKC COMPLEX

Durante il Dottorato di ricerca, mi sono occupata dello studio di due proteine di lievito, la proteinchinasi Bud32 e l’ipotetica proteasi Kae1, che fanno parte di un complesso nucleare denominato KEOPS/EKC. Mentre Kae1 è associata unicamente alle proteine del complesso, Bud32 ha molti altri partner all’interno della cellula; oggetto del mio studio è stata infatti anche la sua forte relazione con la glutaredoxina Grx4. Il complesso di lievito KEOPS/EKC, isolato nel 2006 da due diversi gruppi di ricerca, è coinvolto nell’omeostasi telomerica e nella regolazione della trascrizione. Il complesso è evolutivamente conservato ed è composto da cinque proteine: la chinasi Bud32, l’ipotetica proteasi Kae1, Cgi121, proteina non ancora caratterizzata, e altre due piccole subunità, Pcc1 e Pcc2/Gon7. Per molti anni la nostra attenzione è stata rivolta alla proteinchinasi atipica Bud32, che interagisce con molte altre proteine di lievito, suggerendo come essa possa avere altri ruoli all’interno della cellula. Tra i vari partner di Bud32, abbiamo dimostrato che la glutaredoxina Grx4 risulta essere un substrato della chinasi sia in vivo che in vitro, ed è infatti fosforilata da Bud32 principalmente nella Ser 134. Questa relazione è inoltre a sua volta modulata dalla precedente fosforilazione di Bud32 nella Ser258 da parte della chinasi Sch9 (l’omologa in lievito della chinasi di mammifero Akt/PKB). Durante la prima parte del mio dottorato mi sono concentrata sulla ricerca di un possibile significato fisiologico di questa nuova cascata di fosforilazioni. Analizzando ceppi di lievito che esprimono forme mutagenizzate di Grx4, ho dimostrato come la fosforilazione di Grx4 da parte di Bud32 sia importante per la funzionalità della proteina in vivo. Sfortunatamente, non ho potuto identificare un effetto di questa fosforilazione sulle attività della glutaredoxina, coinvolta nella regolazione dell’omeostasi cellulare del ferro e nella sopravvivenza in condizioni di stress ossidativo. Questi risultati portano all’ipotesi che la fosforilazione di Grx4 da parte di Bud32 giochi un ruolo in qualche funzione diversa e ancora non caratterizzata della glutaredoxina. Ho inoltre verificato se la fosforilazione nella Serina 258 di Bud32 da parte di Sch9 potesse modulare l’attività dell’intero complesso KEOPS, ma l’analisi della lunghezza dei telomeri e del livello di attivazione del gene inducibile GAL1 (uno dei maggiori target trascrizionali di KEOPS) ha rivelato che queste funzioni non erano colpite nel mutante BUDS258A. Questi risultati suggeriscono che la fosforilazione della serina 258 di Bud32 non sia collegata alle funzioni della chinasi nel complesso KEOPS. Ho successivamente indirizzato la mia attenzione alla proteina Kae1. Attraverso l’utilizzo di due ceppi, esprimenti forme mutagenizzate di Kae1, ho potuto dimostrare come l’attività di questa proteina sia essenziale per l’intero complesso, sia a livello dei telomeri che della trascrizione. La funzione biochimica di Kae1 è tuttavia ancora sconosciuta. Inizialmente la proteina è stata classificata come una proteasi, e in effetti nel 2006 è stata indirettamente dimostrata un'attività endopeptidasica per l'omologa umana di Kae1, OSGEP. Al contrario, nel 2007 Hecker et al. hanno dimostrato che l’omologa di Kae1 in Archea è un’AP-endonucleasi. Durante il mio dottorato ho provato a definire l’attività della proteina Kae1 di lievito, ma i risultati ottenuti non sono stati sufficienti per chiarire questo punto. Infine, ho deciso di verificare l’ipotesi, derivante da un recente lavoro in cui viene descritta la struttura atomica del complesso KEOPS negli Archaea, che Kae1 possa essere un substrato di Bud32. Utilizzando le proteine di lievito Bud32 e Kae1, espresse in E.coli, ho osservato che, come accade nelle cellule di lievito, le proteine ricombinanti sono strettamente associate e formano quindi una sorta di sub-complesso catalitico di KEOPS. Utilizzando diverse forme mutagenizzate delle due proteine, in test chinasici in vitro, ho dimostrato che Bud32 è in grado di fosforilare Kae1 e che il legame di Kae1 ha un effetto inibitorio sull’attività catalitica della chinasi. Un’importante conferma è derivata dall’analisi di spettrometria di massa su Kae1 fosforilata, in cui la Ser 367 è stata identificata come target di Bud32. Tuttavia questo potrebbe non essere l’unico residuo fosforilato. Nel complesso, questi dati indicano che, perlomeno in vitro Bud32 e Kae1 vengono reciprocamente regolate. Questo dato è interessante, dal momento che le due proteine potrebbero modulare le funzioni dell’intero complesso KEOPS.