Riprogrammazione di preadipociti umani mediante trattamento chimico

Recenti studi hanno dimostrato che cellule di mammifero differenziate possono de-differenziarsi mediante espressione forzata di definiti fattori per la pluripotenza; la ricerca biomedica sta cercando di ottimizzare le tecniche per l'ottenimento di cellule iPS senza l'uso di materiale genetico virale. Scopo di questo lavoro è stato quello di ottenere cellule iPS virus-free utilizzando la strategia di lavoro proposta di seguito: -Estrazione di precursori da tessuto adiposo di soggetto sano e coltura delle stesse in Preadipocyte Growth Medium o in DMEM addizionato con FCS al 10%. -Caratterizzazione delle stesse cellule mediante ricerca di specifici marcatori nucleari, citoplasmatici e di superficie; a tale scopo ci si è avvalsi di una serie di metodiche tra cui l’analisi citofluorimetrica, saggi citochimici (immunofluorescenza, Oil Red O) e molecolari; -Trattamento delle cellule con 5-azacitidina 10 μM per 48-96 ore; -Esecuzione di saggi di vitalità cellulare (MTT) e osservazione giornaliera mediante microscopia ottica allo scopo di monitorare la morfologia e la crescita delle cellule trattate con azacitidina. -Realizzazione di indagini di Real Time PCR allo scopo di caratterizzare le cellule “riprogrammate” a livello molecolare, ovvero per verificare la sovra-espressione di geni indicatori di staminalità (OCT-4, Nanog, Sox-2) e la down-regolazione di geni tessuto specifici. -Valutazione dell’espressione di fattori di trascrizione specifici delle cellule staminali mediante analisi Western Blot. -Analisi mediante microscopia confocale e citofluorimetria per la definizione delle caratteristiche morfologiche e fenotipiche delle cellule trattate con l’agente demetilante e “riprogrammate”.